ИСТИНА

Открытие и применение белков семейства зеленого флуоресцентного белка (GFP) привело к лавинообразному всплеску интереса исследователей к этим объектам. Их практическая ценность объясняется возможностью маркировать цветными белками клеточные клоны и затем в буквальном смысле наблюдать за ходом внутриклеточных событий. Биотехнологические перспективы применения цветных белков связаны с многоцветной маркировкой и, в частности, с возможностями наблюдать за межбелковыми взаимодействиями в живых системах. Помимо широкого практического использования, цветные белки и их хромофоры являются интереснейшими объектами, изучению свойств которых посвящено большое число экспериментальных и теоретических работ; однако, множество проблем, связанных с особенностями строения и свойств хромофорных молекул белков семейства GFP в разных окружениях, все еще требует детального исследования. Хромофор зеленого флуоресцентного белка, 4-(п-гидроксибензилиден)-5-имидазолинон, представляет собой достаточно большую и сложную молекулу, моделирование свойств которой методами квантовой теории становится возможным лишь в последние годы благодаря доступу к современным суперкомпьютерам тера- и петафлопного уровня и прогрессу в развитии программного обеспечения. Численными решениями уравнений квантовой химии и комбинированных подходов квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) удается надежно рассчитывать фрагменты поверхностей потенциальной энергии в основном и возбужденном состояниях молекулярных систем, моделирующих хромофор GFP в газовой фазе, растворе и в белковом окружении. Эти данные необходимы для интерпретации и уточнения результатов выполненных экспериментальных наблюдений и предсказаний свойств новых систем, включая и более эффективные в приложениях варианты цветных белков. Цель работы – теоретическая интерпретация экспериментальных данных по спектральным свойствам хромофора зеленого флуоресцентного белка в газовой фазе, водном растворе и белке по результатам расчетов поверхностей потенциальной энергии в основном и возбужденном состояниях современными методами квантовой химии. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: 1. Рассчитать фрагменты поверхностей потенциальной энергии основного и возбужденных состояний и оценить теоретически положения полос в спектрах хромофора GFP в различных протонированных формах в газовой фазе. 2. Построить путь цис-транс изомеризации хромофора GFP в основном состоянии в водном растворе. 3. Предложить уточненные трехмерные модели структур GFP на основе расчетов методами КМ/ММ. 4. На основании рассчитанных поверхностей потенциальной энергии основного S0, возбужденного S1 состояний в газовой фазе и в белковой матрице объяснить спектральные свойства хромофора GFP. 5. Предсказать влияние точечных мутаций на спектр GFP в белковой матрице. Научная новизна результатов: 1. Методами квантовой химии высокого уровня точности в рамках единой расчетной схемы рассмотрены все формы хромофора GFP. 2. Уточнена интерпретация спектра анионной формы хромофора GFP в газовой фазе. Показано, что энергия ионизации аниона хромофора GFP в газовой фазе меньше, чем энергия оптически разрешенного перехода π-π*. 3. В рамках континуальной и дискретной моделей растворителя исследована цис-транс изомеризация хромофора GFP в воде. 4. На основании расчетов комбинированными методами квантовой механики – молекулярной механики (КМ/ММ) построены трехмерные модели GFP. 5. По результатам расчетов методом КМ/ММ фрагментов поверхностей потенцильной энергии основного и возбужденного состояний модельных белковых систем сопоставлены теоретические и экспериментальные спектры поглощения и флуоресценции GFP для наиболее важных форм белка. Предложена новая интерпретация превращений GFP при фотовозбуждении.