ИСТИНА

Получены активные и стабильные во времени (не менее 90 дней) препараты пероксидазы хрена, ковалентно иммобилизованной на силикагелях, модифицированных тиоцианатными, изотиоцианатными, эпоксидными и амино-группами с различной длиной углеводородного радикала, связывающего молекулы фермента с носителем.На основании созданного препарата иммобилизованной пероксидазы хрена, ковалентно иммобилизованной на тиоцианатном силикагеле, разработаны ферментативные методики определения фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов с пределами обнаружения 2, 1 и 500 нМ соответственно.Показано, что жесткое закрепление конформации молекул пероксидазы в результате ковалентной иммобилизации позволяет повысить чувствительность (в 2, 10 и 100 раз по сравнению с использованием нативного фермента) и селективность ферментативных методик определения ее неорганических ингибиторов – фторид-, цианид- и тиоцианат-ионов, соответственно. Разработанные методики определения неорганических анионов применены в анализе биологических объектов (крови и слюны) на содержание цианид- и тиоцианат-ионов и питьевых вод на содержание фторид-ионов. Показано, что пероксидаза хрена в более мягких условиях (в отсутствие органических растворителей и нагревания) и эффективнее по сравнению с известным неорганическим катализатором K3[Fe(CN)6] катализирует реакции получения флуоресцирующих производных ее средне окисляемых субстратов − катехоламинов и их метаболитов с использованием мезо-1,2-дифенил-этилендиамина и бензиламина. Продукты дериватизации катехоламинов, полученные в присутствии пероксидазы, идентичны по своему составу и строению дериватизатам, полученным с помощью неорганического катализатора. Разработаны высокочувствительные методики определения катехоламинов: допамина (смин = 10 нМ), адреналина (смин = 1 нМ), добутамина (смин = 60 нМ), метилдопы (смин = 20 нМ) и метаболита – гомованилиновой кислоты (смин = 10 нМ) по флуоресценции продуктов их дериватизации в присутствии нативной пероксидазы с мезо-1,2-дифенилэтилендиамином и бензиламином. Предложены подходы к повышению чувствительности и селективности методик определения катехоламинов и их метаболитов, заключающиеся во введении в сферу реакции полярного органического растворителя ДМСО, прямых мицелл ПАВ и использовании в качестве источника возбуждения флуоресценции лазерного излучения. Показана возможность применения этих методик в анализе биологических объектов на примере определения гомованилиновой кислоты в моче.Выявлено значительное повышение эффективности возбуждения хемилюминесценции флуоресцеина в катализируемой нативной пероксидазой реакции его окисления органическими пероксидами и пероксидом водорода при введении ДМСО. Этот эффект использован для разработки высоко-чувствительных методик определения ограниченно растворимого в воде 2-бутанонпероксида (сн=0,5 нМ) и водонерастворимого трет-бутилгидропероксида (сн=1 нМ). Методика определения трет-бутилгидропероксида применена для анализа нерастворимого в воде пищевого объекта – оливкового масла.