ИСТИНА

При действии на клетки в культуре различных биологически активных молекул, таких как эпидермальпый фактор роста, фактор некроза опухоли — а, лизофосфатидиловая кислота и других биологически активных молекул, происходит активация транскрипционных факторов, в том числе перемещение р65-субъединицы NF-кВ из цитоплазмы в ядро, изменение экспрессии ряда генов и прочие характерные для проведения сигнала события. Одновременно с этим происходит быстрая реорганизация актинового цитоскелета. Опыт показывает, что практически любые биологически активные агенты при взаимодействии с поверхностными рецепторами клетки вызывают подобный эффект. Ранее в нашей лаборатории было показано па клетках разного происхождения, что под действием внешних факторов в течение 10-15 мин происходит последовательная разборка системы актиновых структур с последующим восстановлением исходной организации актинового цитоскелета через 30-40 мин. Механизмы таких перестроек цитоскелета до настоящего времени не установлены. Специфичность же восстанавливаемых структур, по-видимому, определяется характером внеклеточного матрикса на котором распластаны клетки. Также остаётся неясным, связаны ли между собой сигнальные события и процессы цитоскелетных перестроек, и если связаны, то каким образом такая связь может осуществляться. Так как при действии различных агентов происходят аналогичные перестройки у клеток разного происхождения, по-видимому, должны существовать универсальные механизмы, регулирующие этот процесс. При изучении процессов реорганизации цитоскелета было обнаружено, что цитоскелетные белки, которые обычно находятся в составе актин-содержащих структур, выявляются и в цитоплазме в виде отдельных независимых частиц. К таким белкам относятся, в частности, актин-связывающие белки а-актинин-4 и тропомиозин, которые по данным иммупофлуоресценции выявляются в цитоплазме в виде крупных белковых комплексов, не связанных с актиновыми структурами. Функция таких комплексов неизвестна. В литературе высказывается предположение, о том, что эти комплексы вовлечены в процессы реорганизации цитоскелета, а может быть, участвуют и в процессе проведения сигнала. Для выявления их предполагаемых функций, прежде всего надо удостовериться, что такие мультимолекулярные комплексы действительно существуют, затем определить их белковый состав, а также установить, изменяется ли их состав и распределение в клетке в процессе реорганизации цитоскелета под действием различных внешних индукторов. 3. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Цель данной работы состояла в выделении из цитоплазмы культивируемых клеток мультимолекулярных белковых комплексов, содержащих тропомиозин и а-актинин-4, определении их состава и возможного его изменения при перестройках цитоскелета под действием различных индукторов. Для достижения поставленной цели нужно было решить следующие задачи: 1) Разработать метод выделения из цитозоля мультимолекулярных белковых комплексов без полного разрушения культивируемых клеток и нарушения структур актинового цитоскелета. 2) Провести анализ белкового состава мультимолекулярных комплексов, содержащих а-актинин-4 и тропомиозин. 3) Установить, изменяется ли количество и состав этих комплексов в процессе реорганизации актинового цитоскелета под действием эпидермального фактора роста и других биологически активных молекул (трихостатина А, лизофосфатидиловой кислоты, фактора некроза опухоли альфа). Основные положения, выносимые на защиту 1. Разработан новый метод выделения цитоплазматических мультимолекулярных белковых комплексов без разрушения структур актинового цитоскелета. 2. Установлено, что актин-связывающие белки тропомиозин и а-актинин-4 могут существовать не только в структурах цитоскелета, но и в составе не связанных с ним мультимолекулярных комплексов. 3. Показано, что в комплексы, содержащие а-актинин-4, входят также р65-субъединица транскрипционного фактора NF-кВ, белки теплового шока hsp70 и hsp90, а также ряд других белков — актин, миозин-9, спектрин, плектин и кератины. Состав этих комплексов изменяется при действии на клетки эпидермального фактора роста и фактора некроза опухоли- а. 4. В комплексах, содержащих тропомиозин, выявлены р65 субъсдиница NF-kB, hsp70, hsp90 и миозин-9. 5. Установлено, что при действии на клетки ростовых факторов и других внешних лигандов, вызывающих быстрые перестройки цитоскелета, происходят изменения количественного содержания и состава исследуемых белковых комплексов. 6. Совокупность полученных данных приводит к заключению о том, что цитоплазматические мультимолекулярные комплексы могут принимать участие в процессах реорганизации цитоскелета и передачи внутриклеточных сигналов.