ИСТИНА

Выяснение молекулярных механизмов мышечного сокращения является одной из фундаментальных проблем клеточной биологии. На данный момент хорошо известно, что генерация силы сердечной и скелетной мышцей является результатом циклических взаимодействий миозиновых поперечных мостиков с актином и аденозинтрифосфорной кислотой (ATP), которые запускаются освобожде- нием ионов кальция из саркоплазматической сети. В цикле гидролиза ATP поперечные мостики проходят через несколько конформационных состояний, так называемых «сильных» и «слабых» форм связывания миозина с актином [Geeves, Holmes 2005]. Регуляция взаимодействия актина с миозином осуществляется тропомиозином (ТМ) и кальций-чувствительным белком тропонином, которые формируют с F-актином тонкую нить саркомера мышечного волокна. Предполагается, что при низкой концентрации ионов Ca2+ тропомиозин занимает блокирующую позицию на периферии тонкой нити и закрывает участки актина, с которыми миозин способен формировать как сильные, так и слабые формы связывания [McKillop, Geeves, 1993]. Активация сокращения мышеч- ного волокна происходит при увеличении концентрации ионов Ca2+ в цитоплазме и их связывании с тропонином. При этом тропомиозин, изменяя свою конформацию, сдвигается от внешнего домена актина по направлению к центру нити в закрытую позицию, позволяя миозину формировать слабые формы связывания с актином [GaliñskaRakoczy et al., 2008]. Только тогда, когда миозин смещает тропомиозин к внутреннему домену актина в открытую позицию, все области связывания миозина на актине открываются, и между миозином и актином образуются существенные для генерации силы сильные формы связывания [Houmeida et al., 2010]. Нарушение этого взаимодействия и его регуляции вследствие точечных мутаций в мышечных белках приводит к серьезным структурным и функциональным нарушениям в мышечной клетке. Так, в генах тропомиозина идентифицировано большое количество мутаций, вызывающих такие наследственные заболевания, как гипертрофическая и дилатационная кардиомиопатии, немалиновая миопатия, «кэп»-миопатия и дистальный артрогрипоз. Врождённые миопатии разнородны по клиническим, гистологическим и генетическим признакам [Wallgren-Pettersson et al., 2011]. Гипертрофическая кардиомиопатия – одно из серьезных заболеваний миокарда, сопровождающееся его дисфункцией. Это заболевание характеризуется гипертрофией стенок левого желудочка сердца без расширения его полости, усилением систолической и нарушением диастолической функций. При дилатационной кардиомиопатии развиваются дилатации (растяжения) полостей сердца, с нарушением систолической функции без увеличения толщины стенок. Немалиновая миопатия характеризуется мышечной слабостью и наличи- ем немалиновых тел в мышечных волокнах. «Кэп»-миопатия диагностируется при мышечной слабости и обнаружении шапочкообразных, или «кэп»-структур под сарколеммой мышечных волокон. При дистальном артрогрипозе повреждаются дистальные отделы конечностей. Данное заболевание сопровождается мышечными контрактурами, деформацией конечностей, недоразвитием суставов и мышц, фиброзом. Молекулярные механизмы нарушения регуляции сократительной функции мутациями в тропомиозине при этих заболеваниях изучены недостаточно. Цели и задачи работы. Цель настоящей работы состояла в изучении механизма нарушений регуляции тропомиозином взаимодействия актина и миозина, вызванных точечными мутациями в генах ТРМ1 и ТРМ2 тропомиозина человека. В задачи работы входило: 1. Исследовать конформационные перестройки, происходящие в F-актине, субфрагменте 1 миозина, α-тропомиозине сердечных мышц и β-тропомиозинах скелетных и гладких мышц, при моделировании ряда последовательных стадий цикла гидролиза ATP в мышечном волокне. 2. Изучить влияние точечных мутаций Glu180Gly или Asp175Asn α-тропомиозина, ассоциированных с гипертрофической кардиомиопатией, на изменение позиции тропомиозина и на конформационные изменения актина и субфрагмента 1 миозина, происходящие в мышечном волокне в цикле гидролиза ATP. 3. Исследовать характер движения β-тропомиозина скелетных мышц с мутациями Arg91Gly или Glu139del, которые вызывают дистальный артрогрипоз и «кэп»-миопатию, и β-тропомиозина скелетных мышц с мутацией Glu41Lys, которая ассоциирована с немалиновой миопатией, а также влияние этих мутаций на конформационные изменения актина и субфрагмента 1 миозина в АТФазном цикле. 4. Изучить влияние точечной мутации Gly126Arg, вызывающей стабилизацию структуры центральной области α-тропомиозина скелетных и β-тропомиозина гладких мышц, на движение тропомиозина и конформационные изменения актина в цикле гидролиза ATP. Основные положения, выносимые на защиту. 1. В цикле гидролиза ATP существуют несколько различных структурных состояний α-тропомиозина сердечных мышц и β-тропомиозина скелетных и гладких мышц человека, которые отличаются между собой гибкостью тропомиозинового тяжа и его позицией на актиновых нитях. Движение тропомиозина к центру нити (к внутреннему домену актина) сопряжено со смещением равновесия в сторону «включения» мономеров актина и образования сильной формы связывания головок миозина с актином, в то время как движение тропомиозина к периферии актиновой нити (к внешнему домену актина) сопровождается «выключением» мономеров актина и образованием слабой формы связывания головок миозина и актина. 2. Точечные мутации Glu180Gly и Asp175Asn в α-тропомиозине сердечных мышц, Glu41Lys, Arg91Gly и Glu139del в β-тропомиозине скелетных мышц и Gly126Arg в α-тропомиозине скелетных и β-тропомиозине гладких мышц нарушают характер движения тропомиозина на поверхности актиновой нити в цикле гидролиза ATP и вызывают аномальные конформационные изменения актина и головок миозина. 3. Мутации Glu180Gly и Asp175Asn в сердечном α-тропомиозине, ассоциированные с гипертрофической кардиомиопатией, и мутация Arg91Gly в β-тропомиозине скелетных мышц, связанная с дистальным артрогрипозом, приводят к смещению тропомиозина к центру актиновой нити и увеличению относительного количества головок миозина, способных к сильному связыванию с актином, при моделировании большинства стадий цикла гидролиза ATP, что может быть причиной гиперсократимости мышечной ткани при этих мутациях. 4. Замена Glu41Lys в β-тропомиозине скелетных мышц, ассоциированная с немалиновой миопатией, приводит к смещению тропомиозина к периферии тонкой нити на всех стадиях цикла гидролиза ATP и к уменьшению и увеличению относительного количества миозиновых мостиков, сильно связанных с актином, при моделировании, соответственно, сильных и слабых форм связывания актина и миозина, что может объяснить ослабление сократительной функции мышечной ткани при этой мутации. 5. Мутация Glu139del, связанная с «кэп»-миопатией, приводит к смещению тропомиозина к центру актиновой нити и уменьшению относительного количества миозиновых мостиков, сильно связанных с актином, на всех стадиях цикла гидролиза ATP, что может вызывать ослабление сократительной функции мышечной ткани при этой мутации. 6. Замена Gly126Arg в α-тропомиозине скелетных и β-тропомиозине гладких мышц, приводящая к стабилизации структуры центральной области тропомиозинового тяжа, вызывает смещение тропомиозина к периферии актиновой нити, увеличение жесткости С- и N-концевых участков тропомиозина и включение большего количества мономеров актина при моделировании почти всех стадий АТФазного цикла, что свидетельствует об увеличении кооперативности актиновой нити. Научная новизна. Для α-тропомиозина сердечных мышц человека впервые показано, а для β-тропомиозина скелетных и гладких мышц человека подтверждено, что в АТФазном цикле каждому положению тропомиозина на поверхности актиновой нити соответствует определенное структурное состояние актомиозиновой системы, характеризующееся подвижностью и позицией моторного домена миозина, актинового мономера и его субдомена 1. Впервые показано, что точечные мутации тропомиозина, связанные с миопатиями человека, приводят к тому, что движения тропомиозина становятся аномальными и изменяется характер конформационных изменений миозина и актина в цикле гидролиза ATP. Обнаружено, что мутации Glu180Gly и Asp175Asn в сердечном α-тропомиозине, ассоциированные с гипертрофической кардиомиопатией, и мутация Arg91Gly в β-тропомиозине скелетных мышц, связанная с дистальным артрогрипозом, приводят к смещению тропомиозина к центру актиновой нити и активируют образование сильной формы связывания головки миозина с F-актином при моделировании большинства стадий цикла гидролиза ATP, что может вызывать гиперсократимость мышечного волокна. Установлено, что замена Glu139del, связанная с «кэп»-миопатией, приводит к смещению тропомиозина к центру актиновой нити и уменьшению относительного количества миозиновых мостиков, сильно связанных с актином, на всех стадиях цикла гидролиза ATP. Показано, что мутация Glu41Lys в β-тропомиозине скелетных мышц, ассоциированная с немалиновой миопатией, фиксирует тропомиозин в положении ближе к периферии актиновой нити на всех стадиях цикла гидролиза ATP. Такое расположение тропомиозина вызывает ингибирование образования сильной формы связывания головки миозина с актином на финальных стадиях цикла гидролиза ATP, но активизирует формирование этой формы связывания актомиозина при расслаблении мышечного волокна. Эти нарушения в работе актомио- зина могут быть причиной ослабления сократительной функции мышечного волокна. Обнаружено, что замена Gly126Arg в α-тропомиозине скелетных и β-тропомиозине гладких мышц, приводящая к стабилизации центральной области молекулы, вызывает смещение тропомиозина к периферии нити в большинстве стадий АТФазного цикла и существенно увеличивает кооперативность включения мономеров актина. Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют и углубляют представления о молекулярных механизмах регуляции клеточной подвижности и могут быть использованы при чтении курсов лекций по цитологии, клеточной биологии, биофизике, биохимии и физиологии. Новые данные о влиянии точечных мутаций в тропомиозине на его регуляторную функцию существенны для понимания того, какие нарушения характера конформационных перестроек сократительных белков могут лежать в основе таких тяжелых болезней человека, как гипертрофическая кардиомиопатия, дистальный артрогрипоз, немалиновая миопатия и «кэп»-миопатия. Кроме того, полученные результаты могут способствовать разработке тестов для диа- гностики заболеваний мышц человека. Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов кафедры биофизики и биохимии СПбГУ. Личный вклад автора. Все экспериментальные процедуры работы, за исключением получения рекомбинантных форм тропомиозина, проведены автором лично. Поляризационно-флуориметрические эксперименты на мутантной форме тропомиозина Arg91Gly выполнены совместно с А.О. Симоняном. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались с научным руководителем и соавторами, и статьи были подготовлены к публикации при активном участии диссертанта. Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 37-й Европейской мышечной конференции в 2008 г. (Оксфорд, Великобритания), 39-й Европейской мышечной конференции в 2010 г. (Падуя, Италия), 40-й Европейской мышечной конференции в 2011 г. (Берлин, Германия), 41-й Европейской мышечной конференции в 2012 г. (Родос, Греция), 38-м Международном конгрессе Федерации европейских биохимических обществ в 2013 г. (Санкт-Петербург, Россия), 42-й Европейско мышечной конференции в 2013 г. (Амстердам, Нидерланды), Междуродном симпозиу- ме “Биологическая подвижность” в 2014 г. (Пущино, Россия), 43-й Европейской мышечной конференции в 2014 г. (Зальцбург, Австрия), 44-й Европейской мышечной конференции в 2015 г. (Варшава, Польша) и на научных семинарах Лаборатории молекулярных основ клеточной подвижности ИНЦ РАН. Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых научных журналах из списка ВАК РФ. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения (7 стр.), обзора литературы (34 стр.), описания материалов и методов (10 стр.), изложения полученных результатов и их обсуждения (60 стр.), выводов и списка цитированной литературы (259 работ). Работа изложена на 142 страницах, иллюстрирована 22 рисунками и 10 таблицами.