![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Известны два пути регуляции сокращения гладких мышц. Первый – связан с регуляцией миозина. Так, фосфорилирование легких цепей миозина соответствующей киназой после стимуляции Са2+ -кальмодулином, приводит к активации сокращения. Второй – опосредован белками тонких (актиновых) нитей – кальдесмоном и кальпонином. Их присутствие на актиновых нитях приводит к ингибированию сокращения. Эти регуляторные белки действуют на сильную форму связывания миозина с актином. Сокращение любого типа мышц сопровождается циклической сменой слабосвязанного и сильносвязанного состояний между головками миозина и актиновыми нитями. Сильносвязанное состояние (Касс равна 109 М -1), между миозиновой головкой и мономерами актина существует в отсутствие адениновых нуклеотидов. После присоединения молекулы АТР с её последующим гидролизом головкой миозина, последняя претерпевает конформационные изменения, приводящие к ослаблению связи с актиновой нитью. Возникает слабосвязанная форма актомиозина (Касс равна 104 М -1), сопровождающая активацию головки миозина, которая приводит к разрыву связи с актином. Когда такая активированная головка миозина снова приходит в соприкосновение с актином, вновь возникает слабосвязанная форма, которая тут же переходит в сильносвязанное состояние. Конформационный переход слабосвязанного актомиозина в сильносвязанный сопровождается возникновением элементарного усилия, создаваемого одиночной миозиновой головкой. А циклическая работа всех миозиновых головок в конкретной мышце приводит к её сокращению. Возвращаясь к ингибирующему влиянию гладкомышечного кальпонина на сильносвязанную форму актомиозина, следует сказать, что это теоретически может осуществляться на одном из двух шагов актомиозинового цикла. Первый из них возможен на стадии присоединения активированной АТР головки миозина к актиновой нити (McKillop and Geeves, 1993), а второй – при переходе слабосвязанной формы актомиозина в сильносвязанную (Geeves and Halsall, 1987). Из работы (Horiuchi and Chacko, 1991) следует, что кальпонин, при ингибировании актомиозина, осуществляет второй вариант; он не влияет на актомиозиновое взаимодействие, а тормозит изомеризацию головки миозина, что приводит к снижению скорости гидролиза АТР. Надо сказать, что несмотря на многочисленные свойства кальпонина, указывающие на возможность его регулирующей роли в сокращении гладкой мышцы, в настоящее время считается, что он принимает участие в передаче агонист-индуцированного сигнала (Kim et al., 2008), а роль ингибитора гладкомышечного сокращения отводится кальдесмону. Если сравнить потенциальные возможности кальпонина и кальдесмона регулировать гладкомышечное сокращение, то обнаружим между ними большое сходство. Действительно, в гладкомышечных клетках кальдесмон связывается с актином, миозином и тропомиозином (Tм) (Marston and Lehman, 1985; Marston and Huber, 1996). Кальдесмон in vitro взаимодействует с Ф-актином и филаментами миозина (Morgan and Gangopadhyay, 2001). Данные о том, что кальдесмон ингибирует как Mg2+-AТФазу актомиозина (Marston and Huber, 1996), так и развитие изометрической силы в пермеабилизованных волокнах гладкой мышцы (Szpacenko et al., 1985) дают основание утверждать, что кальдесмон является ингибиторным белком. Изучение влияния кальдесмона на конформационные состояния актина и собственное положение кальдесмона при генерации силы в глицеринизированных волокнах показало, что структура и / или способ прикрепления кальдесмона к актину модулируют как возрастание силы, так и переход мономеров актина в цикле АТФазы из выключенного "ВЫКЛ" конформационного состояния во включенное "ВКЛ" (Pronina et al., 2007). Кальпонин, со своей стороны, белок с молекулярной массой 32 кДа, ассоциирован с филаментами тонких нитей и как было ранее предположено, участвует в регуляции сокращения гладких мышц (Takahashi et al., 1986; Winder and Walsh, 1990а). Он, как известно, способен связываться с актином, тропомиозином и кальмодулином (Takahashi et al., 1986; Takahashi et al., 1988a; Childs et al., 1992а) и ингибировать активируемую актином АТФазную активность миозина (Winder and Walsh, 1990а; El-Mezgueldi and Marston, 1996). Это ингибирующее влияние кальпонина является обратимым после его фосфорилирования (Winder and Walsh, 1990а) или добавления Ca2+-кальмодулина (Wills et al., 1993). Кальпонин ингибирует перемещение актина по миозиновым головкам, как показывает тест искусственной подвижности in vitro (Shirinsky et al., 1992; Borovikov et al., 1996а; El-Mezgueldi, 1996). Фосфорилирование кальпонина, как и кальдесмона, предотвращает его связывание с Ф-актином и полностью снимает ингибирование актомиозинового взаимодействия (Khalil and Morgan, 1993). При изучении конформационных изменений в актиновых нитях выяснилось, что и кальпонин и 38 кДа фрагмент кальдесмона ингибируют конформационные изменения Ф-актина, которые присущи состоянию «сильного» связывания между головками миозина и актином (Borovikov et al., 1996б). Кальдесмон и кальпонин могут взаимодействовать с фосфолипидами. Предполагается, что кальпонин и кальдесмон при взаимодействии с фосфолипидами могут принимать участие в формировании цитоскелета (Gusev, 2001). Свойства кальпонина и кальдесмона сравнивают с компонентами тропонина, которые участвуют в регуляции сократительной активности поперечно-полосатых мышц (Gusev et al., 1991). Как следует из этого, далеко не полного перечня свойств, кальпонин и кальдесмон имеют поразительно общие свойства и в равной степени могут претендовать на участие в регуляции сокращения гладких мышц. В этом качестве они рассматривались на протяжении 10 – 15 лет, но затем основное внимание было уделено механизму регуляции гладкомышечного сокращения кальдесмоном. Так, в 2006 году (Alahyan et al., 2006) для определения механизма ингибирования S1-АТФазы исследовали кинетику переходных состояний и определяли скорость элементарных шагов актин-S1-АТФазы под действием именно кальдесмона, а не кальпонина. В связи с этим возникает вопрос, могут ли все свойства, проявляемые кальпонином в отношении ингибирования актомиозиновой АТФазы, быть только побочными свойствами белка, участвующего наравне с десятками других в проведении сигнала? Открытие в запирательной мышце мидии Crenomytilus grayanus актин-связывающего белка с молекулярной массой 40 кДа (Добржанская и др., 2010) и его способности ингибировать Mg2+ -АТФазу миозина, а также гомологичного кальпонину и названного кальпониноподобным (Dobrzhanskaya et al., 2013), вновь поднимает вопрос о роли гладкомышечного кальпонина позвоночных (h1) в регуляции актомиозинового цикла. Актуальность изучения этого белка в мышечной биологии, которая является традиционным разделом клеточной биологии, обоснована тем, что он принадлежит к важнейшему классу белков, а именно, к регуляторным белкам. Причем речь идет о регуляции актин-миозинового взаимодействия, которое составляет молекулярную основу фундаментального свойства живых существ – подвижности. Особую актуальность этому изучению придает тот факт, что проблема роли h1 в регуляции актин-миозинового взаимодействия так и не нашла до сих пор своего решения. В связи с этим, актуальным стало определить молекулярный механизм, с помощью которого кальпониноподобный белок регулирует актин-миозиновое взаимодействие. Знание такого механизма облегчит в дальнейшем решение вопроса о молекулярных механизмах кэтч-состояния, развиваемого запирательной мышцей двустворчатых моллюсков. Определение в данной работе молекулярного механизма, каким кальпониноподобный белок ингибирует актомиозиновое взаимодействие, позволило его сравнить с механизмом ингибирования того же взаимодействия белком h1. Это сравнение показало, что, несмотря на сотни миллионов лет самостоятельного развития беспозвоночных и позвоночных животных, последние сохранили h1, регулирующий актин-миозиновое взаимодействие, хотя в корне изменился его механизм в сравнении с кальпониноподобным белком беспозвоночных. Уже один этот факт ставит под сомнение утвердившееся сейчас представление о том, что только кальдесмон регулирует актомиозиновое взаимодействие в гладких мышцах позвоночных.