ИСТИНА

В задачу третьего года выполнения проекта входило моделирование совместного действия женского полового гормона эстрадиола и хронического влияния гипоксии на проявление симптомов развития легочной гипертонии у овариэктомированных самок крыс линии Wistar. В предыдущих исследованиях было показано, что у самок крыс в отличие от самцов экзогенно вводимый женский половый гормон эстрадиол не оказывает протективного действия на развитие гипоксической формы легочной гипертонии. Эксперименты на овариэктомированных самках при хроническом действии гипоксии не демонстрировали развития легочной гипертонии. Однако, введение различных доз экзогенного эстрадиола этим животным приводило у значимому увеличению величины систолического давления в правом желудочке сердца и его гипертрофии, т.е. введение женского полового гормона на фоне действия гипоксии инициировало развития легочной гипертонии у овариэктомированных животных. Эксперименты, проведенные на фоне действия блокатора эстрадиоловых рецепторов демонстрировали достоверное снижение симптомов развития гипоксической формы легочной гипертонии, что указывает на вовлеченность этих структур в процесс развития хронического повышения артериального давления в малом круге кровообращения или легочной гипертонии. Изучение динамики изменения содержания половых гормонов - эстрадиола и тестостерона в крови овариэктомированных самок с экзогенно вводимом эстрадиолом показало увеличение содержания этих гормонов при действии гипоксии. Максимальное возрастание содержания тестостерона при действии гипоксии наблюдалось в крови группы животных, которым не вводился эстрадиол и которые не демонстрировали развитие легочной гипертонии. Эти данные не позволяют говорить об участии мужского полового гормона в патогенезе развития легочной гипертонии у самок при действии гипоксии. Анализ изменения концентрации эндотелин-1( ЭТ-1) в крови экспериментальных животных и метаболитов оксида азота в пробах их мочи выявил тенданцию к уменьшению обоих показателей. Возможно уменьшение синтеза ЭТ-1 у гипоксических самок при действии эстрадиола приводит к уменьшению синтеза оксида азота, что реализуется в увеличении сосудистого сопротивления и возрастании артериального давления. Возможно, это взаимодействие и является одной из причин отсутсвия протективного действия эстрадиола на развитие гипоксической формы легочной гипертонии у самок.

1.Первая серия экспериментов в отчетном году была посвящена изучению влияния хронического введения женского полового гормона эстрадиола в дозах 5 и 15 мкг/г овариэктомированным самкам, подвергавшихся длительному воздействию гипоксии. Дозы введения эстрадиола овариэктомированным самкам были подобраны в отдельной серии экспериментов в соответствии с поставленной задачей, воспроизвести увеличение содержания женского полового гормона, вводимого экзогенно в соответствии с троекратным увеличением его содержания, которое наблюдается при гипоксии у полноценных животных. Как было показано в предшествующих сериях экспериментов содержание эстрадиола при гипоксии в крови половозрелых самок достигает в среднем 36+8 пмоль/л. При хроническом ежедневном введении эстрадиола в количестве 15 мкг/кг через неделю после введения достигается концентрация содержания эстрадиола в крови в среднем 52+ 12 пмоль/л, что достоверно не отличается от содержания этого гормона в крови половозрелых самок при гипоксии. Кроме того, в экспериментах была использована доза введения эстрадиола в три раза меньше, для моделирования содержания этого гормона в норме у не гипоксических самок. Все серии экспериментов, как говорилось в разделе методы проводились на овариэктомированных самках, с экзогенным введением различных веществ и действии хронической гипоксии. Данные предыдущих экспериментов показали, что у овариэктомированных самок гипоксия не вызывает развития легочной гипертонии, в отличие от животных с сохраненными яичниками. Так как в эксперимент вступало три группы овариэктомированных самок (Ов/к, Ов/ Е2 – 5 (n= 10), группа животных, которым хронически вводился эстрадиол в количестве 5 мкг/кг и Ов/ Е2 – 15 – группа с введением 15 мкг/кг эстрадиола) то для оценки общего состояния животных всех групп проводили еженедельное измерение веса животных. Масса тела животных, изменялась одинаково во всех экспериментальных группах, так что к концу эксперимента различий между группами выявлено не было. Для оценки развития гипоксической формы легочной гипертензии измеряли величину систолического давления в правом желудочке сердца и величину гипертрофии правого желудочка. Кроме того, проводили измерение среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений. После воздействия хронической гипоксии у животных групп Ов/ Е2 – 5 (n= 10) и Ов/ Е2 – 15 (n = 9) наблюдали увеличение СПЖД на 17 % и 23% соответственно по сравнении с группой животных Ов/к (n = 7) (56,7 ± 2,3 и 59,4 ± 3,4 vs 48,3 ± 2,3 мм рт.ст; р<0,05). На основании ранее проведенных исследований систолическое давление в правом желудочке у овариэктомированных самок крыс линии Wistar, не подвергавшихся воздействию хронической гипоксии статистически значимо не отличается от значения данного показателя у группы Ов/к. Изучение степени гипертрофии правого сердца у гипертензивных животных выявило увеличения индекса массы сердца, высчитываемого по формуле ПЖ/вес*10000, у групп Ов/ Е2 – 5 и Ов/ Е2 – 15 в сравнении с Ов/к на 19 % и 13% (7,38±0,21 и 7,03±0,27 vs 6,.22±0,19 , p<0,01 и p<0,05). Эти данные свидетельствуют о развитии легочной гипертензии у групп животных, получавших ежедневно инъекции Е2 в дозах 5 и 15 мкг/кг и подвергавшихся действию хронической гипоксии, в отличие от группы Ов/к, которая также подвергалась действию гипоксии, но ЛАГ у животных этой группы не развивалась. Таким образом, хроническое введение эстрадиола овариэктомированным самкам крыс линии Wistar на фоне действия хронической гипоксии приводит к развитию легочной гипертонии. Для оценки наличия Е2 в организме овариэктомированных самок крыс в работе использовали непрямой метод, в качестве которого было выбрано взвешивание матки, как основного органа-мишени при действии эстрадиола. Для чего после физиологического эксперимента забирали и взвешивали матки животных всех экспериментальных групп. Было показано дозо – зависимое увеличение веса маток крыс после введения эстрадиола в дозах 5 и 15 мкг/кг в день относительно контроля ( 157,4±13,77 и 199,6±11,58 vs 112,8±11,77 мг, p<0,05). Таким образом, можно говорить о том, что хроническое введение женского полового гормона эстрадиол овариэктомированным самкам крыс на фоне действия хронической гипоксии приводит к развитию легочной формы артериальной гипертонии, которая может сопровождаться появлением системной гипертензии. Полученные данные отличаются от результатов, полученных при исследовании монокроталиновой и блеомициновой форм ЛАГ, где эстрадиол проявляет свои протективные свойства на развитие ЛАГ в экспериментах, как у самцов, так и самок крыс (Curr Hypertens Rev., 2009, 5(4): 283-306; J Cardiovasc Pharmacol., 2010, 56(6):696-708). Однако, они укладываются в явление так называемого “эстрадиолового парадокса", которое было выявлено в исследованиях на женщинах с легочной гипертензией, где был показан большой процент заболеваемости ЛАГ у женщин, которые в течение жизни хронически употребляли оральные контрацептивы или использовали гормон замещающую терапию с большим количество эстрадиола (Eur J Med Res, 2009; 14(10):433-42) 2. Для изучения механизма возникновения легочной гипертонии у овариэктомированных самок при действии гипоксии была проведена серия экспериментов с хроническим введением эстрадиола на фоне действия блокатора эстрадиоловых рецепторов. Эксперименты проводились по тому же плану, что и предыдущая серия. В эксперимент вступали только овариэктомированные самки, подвергавшиеся действию хронической гипоксии. Все животные были разделены на 5 групп: Ов/к (n=7), Ов/ Е2 – 15 (n=8) и Ов/ Е2 – 60 (n=10), которым ежедневно вводили Е2 в дозе 15 и 60 мкг/кг в день, Ов/ Е2 - 15+бл (n=10), которым совместно с Е2 в дозе 15 мкг/кг вводили блокатор эстрогеновых рецепторов ICI 182,780 в дозе 150 мкг/кг и группа Ов/бл (n=10), которым вводился только блокатор ICI 182,780 в дозе 150 мкг/кг. Все вещества начинали вводить за две недели до действия гипоксии. Для оценки общего состояния животных всех групп, также как и в предыдущей серии проводился еженедельное измерение веса и систолического системного артериального давления у бодрствующих животных. Масса тела животных, изначально одинаковая у всех животных в начале эксперимента, не изменилась между группами после многочисленных воздействий. Еженедельное измерение систолического артериального давления непрямым методом не выявило никаких отличий между группами. Для косвенной оценки наличия Е2 в организме животного производилось взвешивание маток крыс. Было показано, что эстрадиол увеличивает массы маток крыс в группах получавших его в дозах 15 мкг/кг в день (Ов/ Е2 -15) и 60 мкг/кг в день (Ов/ Е2 – 60), по сравнению с группой Ов/к (312 ± 14 и 370 ± 16 мг vs 202 ± 15 мг, p<0,001). Эффект носит доза-зависимый характер, различия между группами были статистически значимыми Ов/ Е2 – 15 и Ов/ Е2 – 60 (312 ± 14 vs 370 ± 16 мг, p<0,01) . Блокатор эстрогеновых рецепторов, вводимый совместно с Е2 (группа Ов/ Е2+бл), статистически значимо снижает массу матки в сравнении с группами Ов/ Е2 – 15 и Ов/ Е2 – 60, соответственно 215 ±14 vs 312±14 и 370 ± 16 мг, p<0,01 и p<0,001. Интересно, что в группе Ов/бл также наблюдали уменьшение массы матки по сравнению группой Ов/к (соответственно 122 ± 8 vs 202 ± 15 мг, p<0,001). Полученные данные свидетельствуют о том, что вводимый эстрадиол действительно попадает в организм животного и действует на основной орган – мишень, увеличивая вес матки, а введение блокатора эстрадиоловых рецепторов снимает эффект действия гормона. Для оценки степени развития гипоксической формы легочной гипертензии, проводили регистрацию систолического давления в правом желудочке сердца и величину его гипертрофии, как основные симптомы развития исследуемого заболевания. После воздействия хронической гипоксии у животных групп Ов/ Е2 – 15 и Ов/ Е2- 60 наблюдали увеличение СПЖД на 15% и 12,5 % по сравнению с группой Ов/к (соответственно,55,0 ± 1,1 и 54 ,0 ± 1,6 vs 48,0 ± 1,4 мм рт.ст., p<0,01 и p<0,05). Введение только блокатора (Ов\бл) или блокатора совместо с эстрадиолом (Ов/ Е2 - 15+бл) приводило к уменьшению степени развития заболевания по этому показателю. Эти данные свидетельствуют о том, что хроническое введение эстрадиола вызывает развитие легочной гипертензии у овариэктомированных самок, и этот эффект по-видимому, в основном опосредуется через специфические рецепторы к эстрадиолу, так как он снимается на фоне действия блокатора эстрадиоловых рецепторов. При измерении прямым способом системного артериального давления выявлено уменьшение данного параметра у крыс, получавших эстрадиол в дозе 15 мкг/кг в день (Ов/ Е2 – 15 ) в сравнении с контролем (Ов/к) на 10 % (92,3 ± 2,8 vs 102,1±3,1 мм рт.ст.; р<0,05). То есть в большом круге кровообращения наблюдается эффект противоположный тому, что наблюдается в малом круге кровообращения: в малом круге Е2 потенцирует развитие ЛАГ, а в большом круге женский половой гормон уменьшает изменения, вызываемые действием хронической гипоксии, что соответствует литературным данным об эстрадиоле, как об одном из гормонов, ведущих к уменьшению сосудистого сопротивления (Curr Hypertens Rev., 2009, 5(4):283-306). У животных, получавших блокатор эстрадиоловых рецепторов ICI 182,780 в дозе 150 мкг/кг, системное артериальное давление снизилось относительно контроля на 13 % (Ов/к) (102,1±3,1 vs 88,7 ± 3,7 мм рт.ст. ; р<0,05). Данный факт можно объяснить тем, что побочным действием блокатора специфических эстрадиоловых рецепторов ? и ? является стимуляция третьего рецептора к эстрадиолу GPR30. Он находится только на мембране клетки и также стимулирует выработку оксида азота и простациклина, которые вызывают расслабление гладкой мышцы и могут инициировать расслабление сосуда и как следствие, уменьшение сосудистого сопротивления и величины системного артериального давления. Полученные данные указывают на то, что у овариэктомированных самок введение эстрадиола на фоне действия гипоксии приводит к развитию легочной гипертензии, так как это наблюдается у нормальных половозрелых животных. Эффект достоверно снижается на фоне действия блокатора эстрадиоловых рецепторов, что позволяет говорить о вовлеченности специфических рецепторов к эстрадиолу в патогенез возникновения гипоксической формы легочной гипертонии у овариэктомированных самок. 3. В этих же сериях экспериментов проводилось измерение содержания мужского полового гормона тестостерона во всех экспериментальных группах на фоне введения эстрадиола до, во время и после воздействия гипоксии. Изучение динамики изменения тестостерона показало, что на фоне действия хронической гипоксии наблюдается увеличение содержания этого гормона в плазме крови как контрольных животных, так и в группе крыс, которым хронически вводили эстрадиол в дозе 15 мкг/кг веса животного. Количественные изменения в обеих группах были сравнимы. Однако, в группе контрольных животных мы не наблюдали развития легочной гипертонии, а в группе с эстрадиолом было зарегистрировано как увеличение величины систолического давления в правом желудочке сердца, так и его гипертрофия. Эти данные позволяют прийти к заключению, что увеличение содержания тестостерона в крови экспериментальных животных во время действия гипоксии не связано с развитием легочной гипертонии в группе животных с хроническим введением эстрадиола. 4. Учитывая, описанный в литературе, протективный эффект действия эстрадила на состояние сердечно-сосудистой системы в норме и при некоторых формах легочной гипертонии, опосредованный увеличением синтеза оксида азоты, мы исследовали продукцию метаболитов NO – нитритов/нитратов в моче животных всех экспериментальных груп. Суточная моча собиралась через две недели после начала ежедневного введения эстрадиола, т.е. перед началом действия гипоксии и через две недели после их совместного воздействия. Сравнение данных по экскреции NO метаболитов до воздействия гипоксии, но после 2-х недельного применения эстрадиола овариэктомированным самкам показало уменьшение этого показателя в группах с инъекцией гормона (15 мкг/кг) по сравнению с контролем (4,89+1,22 vs 8.27+1,50мкмоль/кг). После двух недельного воздействия гипоксии наблюдалось увеличение экскреции NO метаболитов во всех экспериментальных группах. Однако, в наибольшей степени этот эффект был выражен в контрольной группе, где проводилась ежедневное введение растворителя. В то время, как в группах с введением эстрадола наблюдалось доза-зависимое уменьшение выведения NO метаболитов. Так в группе, где проводилось введение 15 мкг/кг эстрадиола оно составило 3,79+1,95мкмоль/кг, а в группе, где вводилось 60 мкг/кг эстрадиола – 1,40+1,44 мкмоль на кг. У самок в норме концентрация ЭТ-1 в плазме крови в среднем равнялось 20,63 фмоль/мл и при развитии гипертонии имело тенденцию к уменьшению, составляя 18,96 фмоль/мл. Таким образом, введение эстрадиола овариектомированным самкам приводит к уменьшению экскреции NO метаболитов, что не сопровождается изменением циркулирующей концентрации ЭТ-1. Хроническая гипоксия потенциирует эффект экскреции метаболитов NO, но он выражен в меньшей степени в группах, у животных которых развивается легочная гипертония.