ИСТИНА

Основной целью предлагаемого проекта является изучение механизмов, обеспечивающих повышенную стабильность спермоспецифичной формы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФДс) и других белков, характерных для сперматозоидов. Ранее нами было показано, что ГАФДс существенно отличается от соматической формы фермента повышенной стабильностью. Было сделано предположение, что это обусловлено наличием 2-х дополнительных скрытых ионных связей, а также с присутствием 6 дополнительных остатков пролина в определенных участках полипептидной цепи. В предлагаемом проекте для доказательства данного предположения мы планируем исследовать вклад перечисленных аминокислотных остатков в термостабильность dN-GAPDS с помощью направленного мутагенеза данных остатков. Нами будут получены мутантные белки с заменой трех остатков пролина, находящихся в первом положении альфа-спиралей, на аланин (P111A, P157A, и P326A), с заменой трех остатков пролина, находящихся во втором положении бета-изгибов, на аланин (P164A, P197A, и P213A) и с заменой аминокислотных остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот, вовлеченных в образование солевых мостиков, на нейтральные остатки аспарагина и глутамина (D311N и E244Q). Прежде всего будет исследована стабильность полученных мутантов методом дифференциальной сканирующей калориметрии, их физико-химические и каталитические характеристики, а также особенности амилоидогенных превращений, характерных для ГАФД, при изменении стабильности различных форм белка. Кроме того, будет исследована роль эукариотического цитоплазматического шаперонина TRiC/CCT в правильном сворачивании спермоспецифичных ферментов, обладающих повышенной стабильностью и дополнительными полипептидными фрагментами. В основе этой части исследований лежит предположение о том, что очень высокое содержание шаперонина TRiC в тканях, где происходит созревание сперматозоидов, обусловлено не столько интенсивным синтезом белка в клетках-предшественниках сперматозоидов, сколько необходимостью шаперонина для правильного сворачивания и, возможно, встраивания в структурные элементы сперматозоидов спермоспецифичных белков. Шаперон-зависимое сворачивание будет изучено как на нативных ферментах, так и на описанных выше мутантных формах с измененной стабильностью. В частности будет исследована роль шаперонина в амилоидогенной трансформации различных форм ГАФД. Так как существуют сведения о возможном вовлечении ГАФД и ГАФДс в развитие нейродегенеративных заболеваний, нами также планируется поиск соединений, способных влиять на возникновение патологических агрегатов, содержащих данный белок.

Начато исследование структурных особенностей рекомбинантной спермоспецифичной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (dN-GAPDS), обеспечивающих повышенную стабильность этой изоформы фермента по сравнению с соматической глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (GAPD). В проекте было запланировано получение рекомбинантных белков dN-GAPDS, содержащих мутации аминокислотных остатков, которые могут быть необходимы для стабилизации dN-GAPDS (это дополнительные остатки пролина и остатки, вовлеченные в образование дополнительных солевых мостиков). На данном этапе было получено три мутантных белка dN-GAPDS с заменами пролина на аланин (P111A, P157A, и P326A). Стабильность полученных белков исследовали тремя методами: флуориметрическим методом определяли концентрацию гуанидингидрохлорида, при которой количество денатурированного белка равно количеству нативного (GdnHCl50). Температуру максимума кривой теплопоглощения (Тм) определяли методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Кроме того, измеряли скорость инактивации белков в присутствии 4 М GdnHCl. Среди трех исследованных мутаций пролина только одна (P326A) привела к существенному снижению стабильности мутантного белка по сравнению с диким типом, что проявлялось в снижении величины Тм на 6 градусов, а также небольшом увеличении константы инактивации в присутствии 4 М GdHCl (с 0,13 до 0,15 мин-1) и снижении параметра GdHCl50 (с 1,89 М до 1,79 М). В ходе исследования различных мутантных форм белка dN-GAPDS было показано, что разрушение межсубъединичного мостика между D368 и R269 (мутация D368N) приводит к образованию неактивной формы фермента, склонной к агрегации. Полученные агрегаты были проанализированы на содержание амилоидных структур. Показано изменение спектра флуоресценции тиофлавина Т при добавлении к раствору красителя суспензии агрегатов, содержавших мутантный белок D368N. Таким образом, была выявлена мутация в белке dN-GAPDS, которая приводит к образованию белка с повышенной склонностью к агрегации и к образованию амилоидоподобных агрегатов. Проверено влияние точечных мутаций на эффективность шаперонин-зависимой ренатурации dN-GAPDS в присутствии шаперонина Tric/CCT. Было показано, что замена остатков пролина P111, P157, P326 на аланин не оказывает влияния на эффективность шаперонин-зависимой ренатурации мутантных белков по сравнению с белком дикого типа.