ИСТИНА

Аллостерическая регуляция – одно из направлений разработки лекарственных препаратов нового поколения. На сегодняшний день в медицинской практике для лечения дегенеративных и онкологических заболеваний применяются нековалентные ингибиторы ферментов, связывающиеся в активном сайте и, таким образом, блокирующие субстратные превращения. Разработка препаратов, воздействующих на белковые функции посредством аллостерической передачи сигнала, имеет целый ряд преимуществ, включая их повышенную специфичность и пониженную токсичность. Аллостерический эффект достигается за счёт перераспределения в ансамбле белковых конформаций и описывается кинетическими моделями, представляющими конформационное пространство как набор из нескольких макро-состояний, связанных через матрицу вероятностей переходов. В современной компьютерной химии поиск областей на поверхности белка, связывание в которых приводит к изменению функции, производится через поиск известных структурных мотивов в статичной структуре белковой системы и оценку энергии взаимодействия с предполагаемым эффектором. Однако такой подход зачастую неэффективен для областей белка с высокой подвижностью и сайтов, формирующихся только в процессе динамики. Данный проект предполагает создание и применение нового подхода к поиску аллостерических сайтов и их описанию на примере малой ГТФазы RAS – белка, участвующего в сигнальных процессах клетки. Предлагаемая методика основана на применении кинетической модели Марковских состояний и модели динамического сетевого анализа к набору коротких (до 100 нс) молекулярно-динамических траекторий белковой системы общей протяжённостью до 10 миллисекунд. Такой подход позволит обнаружить потенциальные аллостерические сайты, описать механизмы передачи биологического сигнала и рассчитать константы скорости и свободные энергии Гиббса процессов перехода между активными и неактивными состояниями системы.

Allosteric regulation is one of the main perspective in novel rational drug design. At present for treatment of degenerative and oncology pathologies a large variety of non-covalent inhibitors are being applied. Their mechanisms of action is achieved via binding in active site and reducing the ability to perform substrate conversion. Development of drugs based on allosteric signal transmission has a number of considerable advantages to offer including higher specificity and safe dosing. Protein allostery is a shift in equilibrium populations of different conformations and it could be defined in terms of kinetic model that describes the conformational space as a number of macrostates connected through transition probability matrix. Modern computational approaches enable to locate allosteric site in a static manner, namely comparing regions on the protein surfaces with known allosteric site pockets and scoring its geometrical and energy binding characteristics. However, some allosteric sites could be coupled only with molecular dynamics simulations. Present project is dedicated to development and approbation of new technique based on Markov State Model and Dynamical Network Analysis of protein dynamics for a set of molecular trajectories no longer than 100 ns each and up to 10 ms in total. The method proposed offer a tool for dynamical location and characterization of perspective allosteric sites in a small GTPase protein RAS involved in signal transmitting within cell. The project implies revealing regions of allosteric signaling, constructing the biological perturbation paths through the protein structure and computing the kinetic constants and Gibbs energies for functional transitions.

С помощью новейших методов статистического анализа молекулярно-динамических траекторий описать механизмы медленных конформационных переходов, лежащих в основе каталитической активности белкового комплекса RAS-GAP, и предложить способы её регуляции. Задачи проекта 1. Рассчитать молекулярно-динамические траектории протяжённостью до 1 миллисекунд для систем RAS-ГТФ (мономер и димер), способных к связыванию с эффектором, и неактивных систем RAS-ГДФ и RAS-NS1. 2. Построить кинетические модели на основе рассчитанных траекторий по методу МСМ и рассчитать времена конформационных переходов и соответствующие изменения свободной энергии Гиббса. Выделить области, перспективные для аллостерического воздействия, методами, описанными ниже. 3. По равновесным траекториям изучаемых систем создать сетевую модель динамики для определения путей передачи биологического сигнала от выбранных областей на поверхности белка до Switch II (для систем RAS-ГТФ и RAS-ГДФ) или до аминокислотных остатков, отвечающих за белок-белковые взаимодействия в димере RAS (для систем димера RAS и RAS-NS1). 4. Проверить найденные пути передачи сигнала на наличие известных точечных мутаций, влияющих на функции RAS. 5. Предложить наиболее перспективные сайты аллостерической регуляции процесса дезактивации RAS.

Руководитель проекта Коц Е. Д. занимается методами молекулярно-динамического описания белковых систем более 4-х лет. Основной вклад Коц Е. Д. в перечисленные ниже работы заключался в моделировании биохимических свойств белковых структур квантовыми и молекулярно-механическими методами. Коц Е.Д. является автором более 10 публикаций в системе Web of Science (h=3), все работы были выполнены автором на современном уровне и опубликованы в реферируемых научных изданиях. Использование модели состояний Маркова и динамического сетевого анализа (ДСА) для описания свойств аллостерического сайта белка аспартоацилаза были описаны автором в публикациях. Метод ДСА был использован в этих работах для построение оптимальных путей передачи сигнала от локализованного другими методами аллостерического сайта на поверхности белка до активного центра. Обнаруженное уменьшение длины путей и увеличение их количества при переходе от нативной формы белка к связанной с регулятором послужило доказательством перспективности предложенного сайта. Также в работе было описано влияние димеризации аспартоацилазы на её каталитическую активность. По результатам расчёта молекулярно-динамических траекторий, открытие ворот транспортного канала осуществляется только в димерной форме, тогда как в мономере аспартоацилазы образование белок-субстратного комплекса затруднено. Системы малых ГТФаз были исследованы автором и исполнителем проекта. Комбинированными методами КМ/ММ была описана химическая стадия ферментативного катализа комплекса RAS-GAP – гидролиз ГТФ. Был предложен механизм ферментативного гидролиза ГТФ родственного комплекса ARL3-RP2. Рассчитанный ИК-спектр выявил наличие молекулярных колебаний ключевых интермедиатов, позволяющих подтвердить их существование методами спектроскопии.

По окончании данного проекта планируется обнаружить несколько потенциальных мест воздействия аллостерического регулятора, способствующего переходу белка RAS в неактивную конформацию. По результатам проведённой статистической обработки МД траектории методом МСМ будут рассчитаны времена взаимных переходов между активной и неактивными формами RAS. Сопоставление этих значений с существующими в литературе кинетическими параметрами скорость-лимитирующих процессов изучаемой системы поможет оценить степень достоверности и границы применимости предлагаемой методики к решению задач конформационного анализа. Благодаря изучению двух видов неактивных систем RAS - в комплексе с ГДФ и с монотелом NS1, будет возможно обнаружить аллостерические сайты, способные оказывать влияние и на процесс димеризации RAS и на положение Switch областей белка. Построение сетевых моделей трёх систем позволит не только оценить перспективность выбранных сайтов, но также вынести предположение о механизме воздействия существующих точечных мутаций вне активного центра (A83T, T144I, R164A, Q165V) на «выключение» RAS.