ИСТИНА

Данный проект будет выполняться в рамках задач совместной лаборатории (МАЛ) LIA1066. В рамках проекта предполагается провести несколько групп экспериментов, часть из которых будет выполняться французским партнером. Целью предлагаемого к выполнению проекта является идентификация структурно-функциональных областей экстрацеллюлярного домена муцина MUC1 человека, презентация которых на поверхности опухолевой клетки приводит к изменению метастатического потенциала. Имеющиеся к настоящему времени литературные данные позволяют предположить, что различные области высокогликозилированного экстрацеллюлярного домена муцина MUC1 играют ключевую роль в изменении метастатического потенциала клетки. Более того, ряд экспериментальных результатов указывает на двойственную роль данной области при метастазировании. C одной стороны, она способствует отделению опухолевых клеток от первичного очага, с другой стороны – опосредует прикрепление метастазирующих клеток к эндотелию сосудов. Реализация данного проекта позволит выявить конкретные фрагменты экстрацеллюлярного домена муцинового гликопротеида MUC1, влияющие на способность опухолевых клеток мигрировать через искусственный эндотелий и, возможно, объяснить причины двойственной роли MUC1 в процессе метастазирования. В качестве экспериментальной модели планируется использовать клетки, стабильно трансфицированные конструкциями, несущими гены слитых с GFP белков, составленных из различных фрагментов муцина MUC1 человека. Стабильные линии будут получены на базе клеток аденокарциномы кишки человека (линия HT-29), характеризующихся низкой экспрессией эндогенного MUC1 и невысоким метастатическим потенциалом. Способность клеток к метастазированию предполагается оценивать по их способности к трансэндотелиальной миграции in vitro. На завершающем этапе выполнения проекта планируется оценить способность клеток полученных модельных линий к образованию метастазов в легких безтимусных мышей.

1. Было получено 7 генетических конструкций: pL-F-TR21-TMCT-EGFP, pL-F-TMCT-EGFP, pUSTR-F-TR21-TMCT-EGFP, pL-F-TR21-TM, pUSTR-F-TMCT-EGFP, pUSTR-F-TR21-TM-EGFP, pUSTR-F-TM-EGFP. Конструкции содержат фрагменты, кодирующие следующие функциональные фрагменты муцина MUC1 человека: L - лидерный пептид; USTR-область, располагающаяся выше области тандемных повторов и включающая лидерный пептид; TR21 - 21 повтор из области тандемных повторов; TM - трансмембранный домен, TMCT - трансмембранный и цитоплазматический домены. Помимо слитых генов, кодирующих различные функциональные фрагменты муцина MUC1 человека, в состав данных конструкций входит фрагмент, кодирующий FLAG-эпитоп, узнаваемый моноклональным антителом М2, а также последовательность, кодирующая зеленый флуоресцентный белок (EGFP). Последовательность слитых генов в составе всех конструкций проверена секвенированием. 2. По распределению флуоресценции EGFP в клетках линии HeLa, транзиентно трансфицированных вышеописанными генетическими конструкциями, определена клеточная локализация белков, слитых с EGFP. Было установлено, что EGFP, экспрессирующийся в клетках, трансфицированных контрольной плазмидой (pEGFP-N3), накапливается, в основном, в ядре, а также в цитоплазме. В то же время, флуоресценция EGFP в клетках, трансфицированных плазмидами, содержащими функциональные фрагменты муцина MUC1 человека, отсутствует в ядре и наблюдается в цитоплазме и на мембране клеток. 3. Окрашивание непермеабилизованных клеток антителами на FLAG-эпитоп, конъюгированными с красителем AlexaFluor542 и определение колокализации флуоресценции EGFP и красителя AlexaFluor542 подтвердило мембранную локализацию рекомбинантных белков. На основании данных по колокализации флуоресценции были выбраны конструкции для создания стабильных трансфектантов на основе клеток линии HT-29 – pEGFP-N3 (контрольная), pUSTR-F-TM-EGFP, pUSTR-F-TR21-TMCT-EGFP. 4. Была отработана методика трансфекции клеток линии HT-29, с использованием которой были получены стабильные трансфектанты HT-29_EGFP, HT-29_USTR-TM-EGFP, HT-29_USTR-TR-TMCT-EGFP. 5. Методом ПЦР в реальном времени определен уровень экспрессии рекомбинантных белков в стабильно трансфицированных клетках. Кроме того, установлено, что уровень экспрессии эндогенного мембраносвязанного муцина MUC1 составляет около 12 % от уровня экспрессии рекомбинантных белков. 6. Установлено, что рекомбинантные белки, содержащие функциональные фрагменты муцина MUC1 человека имеют периферическую мембранную локализацию, характерную для опухолевых клеток. 7. Получена модель эндотелия, представляющая собой пористый матрикс с располагающимся на его поверхности монослоем из эндотелиальных клеток. Произведена оценка адекватности данной модели путем определения трансэндотелиальной миграции клеток различной инвазивности – высокоинвазивных (MDA-MB-231) и низкоинвазивных (HT-29). 8. С использованием полученной модели произведено сравнение трансэндотелиальной миграции стабильно трансфицированных клеток HT-29_EGFP, HT-29_USTR-TM-EGFP, HT-29_USTR-TR-TMCT-EGFP. В результате проведенного эксперимента было установлено, что клетки HT-29_USTR-TM-EGFP и HT-29_USTR-TR-TMCT-EGFP обладают повышенной способностью к миграции по сравнению с контрольной линией HT-29_EGFP.