ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Противоопухолевые антибиотики занимают важное место среди препаратов, используемых в химиотерапии онкологических заболеваний. Очень важно определение клеточных мишеней и понимание механизма действия этих препаратов. Ранее было показано, что эти препараты, нарушая структуру двойной спирали, оказывают влияние на процессы репликации и транскрипции. Открытие новых аспектов механизма действия этих соединений значительно расширит потенциал их терапевтического применения. В проекте впервые будет детально исследовано влияние перспективных противоопухолевых препаратов, обладающих способностью связываться с ДНК, на функционирование одного из важнейших ДНК-оперирующих ферментов - метилтрансферазы (МТазы) Dnmt3a in vitro. Будут исследованы препараты, интеркалирующие в двойную спираль (доксорубицин и кураксин) и располагающиеся в малой бороздке (производное оливомицина А LCTA-1599). Влияние этих соединений на действие МТаз не изучалось. Вместе с тем, МТаза Dnmt3a может быть чувствительна к такого типа нарушениям структуры ДНК. Это подтверждают полученные в нашей лаборатории данные об ингибировании Dnmt3a малобороздочными ДНК-лигандами - димерными бисбензимидазолами, а также ухудшение метилирования этим ферментом ДНК субстратов, поврежденных интеркалирующим канцерогеном бензо[а]пиреном. Будет проведено связывание и метилирование специально сконструированных ДНК-субстратов МТазой Dnmt3a в присутствии исследуемых противоопухолевых препаратов. Мы ожидаем, что метилирование ДНК-субстратов МТазой Dnmt3a будет ингибироваться как интеркалирующими препаратами доксорубицином и кураксином, так и малобороздочным лигандом LCTA-1599. Информация о влиянии рассматриваемых нами препаратов на метилирование, катализируемое МТазой Dnmt3a, расширит понимание механизма их действия, откроет пути к персонализированной таргетированной терапии рака, комбинированному использованию эпигенетической и традиционной терапии рака, поможет искать новые пути преодоления устойчивости к традиционным лекарствам.
Antitumor antibiotics occupy an important place among the drugs used in the treatment of oncological diseases. It is very important to determine the cellular targets and to understand the mechanism of action of these drugs. It was shown earlier that these drugs influence the processes of DNA replication and transcription by disturbing the structure of the double helix. The discovery of new aspects of the mechanism of action of these compounds will greatly expand their potential for therapeutic application. The project will, for the first time, thoroughly investigate the effect of promising DNA binding antitumor agents on the functioning of one of the most important DNA-operating enzymes – DNA methyltransferase (MTase) Dnmt3a in vitro. DNA intercalating agents (doxorubicin and curaxin CBL0137) and minor groove binders (olivomycin A derivative LCTA-1599) will be investigated. The impact of these compounds on the functioning of MTases has not been studied before. However, Dnmt3a may be sensitive to these types of structural perturbations of DNA. This is confirmed by the data that were obtained in our laboratory. These data indicate inhibition of Dnmt3a by minor groove binders, dimeric bisbenzimidazoles, as well as the reduction of Dnmt3a-catalyzed methylation rate of DNA damaged by intercalating carcinogen benzo[a]pyrene. The binding and methylation of specially designed DNA substrates by Dnmt3a in the presence of the antitumor drugs will be conducted. We expect that the methylation of DNA substrates by Dnmt3a will be inhibited both by intercalating agents curaxin CBL0137 and doxorubicin and by the minor groove binder LCTA-1599. Information on the impact of these drugs on Dnmt3a-catalyzed DNA methylation will broaden understanding of their mechanism of action, open the way for personalized targeted cancer therapy through the combined use of epigenetic and traditional cancer therapy and help to find new ways to overcome resistance to traditional drugs.
Одним из наиболее эффективных подходов для лечения раковых заболеваний является химиотерапия с использованием соединений, интеркалирующих в ДНК. Таким соединением является антрациклиновый антибиотик доксорубицин. В основном, ДНК-интеркаляторы нацелены на ингибирование ДНК-полимераз и топоизомераз, что приводит к апоптозу раковых клеток. В случае интеркалирующего соединения кураксина, обладающего противоопухолевой активностью, наблюдается сложная цепь событий, приводящая к нарушению гистонового кора нуклеосом и активации р53. В нашей лаборатории в совместных работах с Нью-Йоркским университетом были охарактеризованы последствия ковалентного присоединения к CpG-участкам ДНК канцерогена бензо[а] пирена и показана разная локализация изомеров канцерогена по отношению к двойной спирали: интеркалирующая для цис-изомеров и малобороздочная для транс-изомеров. В обоих случаях наблюдалось ингибирование МТазы Dnmt3a (Minero et al,2015). Учитывая этот опыт, мы ожидаем, что метилирование ДНК МТазой Dnmt3a будет ингибироваться как антрациклиновым антибиотиком доксорубицином, так и кураксином. В любом случае, информация, полученная в опытах in vitro, может представлять интерес как новый механизм активности интеркалирующих противоопухолевых агентов, которые повреждают ДНК. Таким образом, Dnmt3a можно рассматривать как одну из мишеней действия доксорубицина и кураксина. Можно предположить, что уровень экспрессии Dnmt3a в раковых клетках будет оказывать влияние на эффективность лечения доксорубицином. Тогда по этому параметру можно будет оценивать цитотоксичность лекарства и корректировать его дозы. В случае малобороздочного ДНК-лиганда оливомицина А в своих прогнозах о его ингибирующем действии мы опираемся на данные нашей лаборатории по эффективному ингибированию МТазы Dnmt3a малобороздочными ДНК-лигандами –димерными бисбензимидазолами разной структуры (Cherepanova et al, 2010 и Ivanov et al, 2015).
В нашей лаборатории ведется планомерное исследование ингибирования С5-МТаз с целью выявления новых противораковых препаратов, а также исследование влияния уже известных противораковых лекарств на функционирование ДНК-метилтрансфераз (Кирсанова и др, 2009). Нами было открыто, что эффективного ингибирования метилирования можно достигать, используя малоборозночночные ДНК-лиганды. Например, в качестве таких ингибиторов были исследованы целые серии димерных бисбензимидазолов DB(n) и DBP(n), которые состоят из двух остатков аналога красителя Хёхст 33258, соединенных линкерами различной длины. В микромолярных количествах они ингибировали метилирование синтетического односайтового ДНК-субстрата МТазами Dnmt3a и SssI. Обнаружено, что они не токсичны для клеток, мало влияют на глобальное метилирование ДНК в клетках, но могут снижать метилирование отдельных участков (Дарий и др., 2013; Ivanov et al, 2015). Из реальных противораковых препаратов в нашей лаборатории были детально исследованы пиримидинон-2 (Р, зебуларин) и 6-тиогуанин (SG). Они проявляют свое ингибирующее действие только будучи встроенными в ДНК-субстрат в определенную позицию по отношению к цитозину-мишени. Пиримидинон-2 относится к механизмзависимым ингибиторам. Ингибирующую активность Р-ДНК изучали как по оценке эффективности образования конъюгатов Р-ДНК с МТазами, так и по влиянию добавления ингибиторных Р-ДНК на метилирование ДНК-субстратов этими ферментами (Subach et al, 2004). Детально исследовано влияние SG на функционирование МТазы Dnmt3a. SG включали в один или в два CpG-участка узнавания Dnmt3a вместо остатка гуанина, что приводило к ухудшению скорости метилирования, при этом SG не влиял на формирование фермент-субстратных комплексов. Интересно, что другие модификации остатка гуанина рядом с цитозином-мишенью, например, 8-оксогуанин, O6-метилгуанин и аддукты гуанина с бензо[a]пирендиолэпоксидами также влияли на функционирование Dnmt3a.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 20 марта 2018 г.-20 марта 2019 г. | Влияние противоопухолевых препаратов, связывающихся с ДНК, на функционирование ДНК-метилтрансферазы мыши Dnmt3a |
Результаты этапа: Ранее в нашей лаборатории были получены данные об ингибировании метилирования ДНК некоторыми препаратами, способными интеркалировать в ДНК (бензо[а]пирен) или связываться с её малой бороздкой (димерные бисбензимидазолы DB(n)). В связи с этим, данный проект направлен на изучение влияния перспективных противоопухолевых препаратов, обладающих способностью связываться с ДНК, на функционирование метилтрансферазы (МТазы) Dnmt3a in vitro. Dnmt3a переносит метильную группу с кофактора S-аденозил-L-метионина в 5 положение цитозина-мишени в CpG-участках ДНК, устанавливая таким образом рисунок метилирования ДНК в эукариотических клетках. Объектами исследования выбраны препараты, интеркалирующие в двойную спираль (доксорубицин и кураксин CBL0137) и располагающиеся в малой бороздке (оливамид LCTA-1599, производное оливомицина А). В работе использован каталитический домен МТазы мыши Dnmt3a (Dnmt3a-CD), сохраняющий активность в отсутствие регуляторного домена. За отчетный период было детально изучено влияние оливамида на функционирование Dnmt3a-CD, а также получены первые данные о влиянии кураксина на метилирование ДНК. 1. Выделение Dnmt3a-CD Dnmt3a-CD экспрессировали в клетках E. coli BL21 (DE3), несущих плазмиду pET28a с геном, кодирующим Dnmt3a-CD, содержащую N-концевой His6-кластер. Выделение фермента производили с помощью металл-аффинной хроматографии на Со2+-содержащей смоле Talon®. Чистота выделенных белковых препаратов была оценена с помощью электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле по Леммли и составила >95%. 2. Конструирование ДНК-субстратов Первым этапом работы стала разработка удобной модельной системы для изучения влияния этих препаратов на функционирование Dnmt3a-CD. Для этого были сконструированы 30-звенные ДНК-дуплексы, содержащие метилируемый CG-сайт внутри последовательности GCGC, с которой способен связываться оливамид. Кроме того, последовательность GCGC является участком расщепления эндонуклеазы рестрикции R.Hin6I. В один из ДНК-дуплексов были вставлены флуоресцентные FAM-метки на 5’-концы каждой из цепей. Последовательность ДНК-дуплекса 1: 5-CTGAATACTACTTGCGCTCTCTAACCTGAT 3-GACTTATGATGAACGCGAGAGATTGGACTA Последовательность ДНК-дуплекса 2: 5-FAM-CTGAATACTACTTGCGCTCTCTAACCTGAT 3-GACTTATGATGAACGCGAGAGATTGGACTA-FAM 3. Оливамид Оливамид (“LCTA-1599”) является противоопухолевым антибиотиком группы ауреоловой кислоты (АК), включающей также митрамицин, хромомицины и дурамицин. Противоопухолевое действие оливомицина А связано с его способностью связываться с малой бороздкой ДНК в GC-богатых участках в виде Mg2+-координированных комплексов. Полусинтетический аналог оливомицина А, N,N-диметиламиноэтиламид 1'-дез-(2,3-дигидрокси-н-бутироил)-1'-карбокси-оливомицина А (оливамид) обладает улучшенными фармакологическими свойствами по сравнению с исходным соединением. Влияние этих соединений на метилирование ДНК ранее не изучалось. При связывании с ДНК интенсивность флуоресценции антибиотиков группы ауреоловой кислоты при λвозб 550 нм увеличивается. В связи с этим, связывание оливамида с ДНК-дуплексом 1 было определено по увеличению флуоресценции оливамида при добавлении в смесь ионов Mg2+, необходимых для образования комплексов исследуемых антибиотиков с ДНК. Для исследования влияния оливамида на эффективность реакции метилирования мы использовали метод определения эффективности метилирования ДНК по защите от расщепления эндонуклеазами рестрикции. Для формирования комплекса ДНК с оливамидом ДНК-дуплекс 2 инкубировался с антибиотиком в присутствии ионов Mg2+ с последующим метилированием дуплекса МТазой Dnmt3a. После этого ДНК-дуплекс расщепляли эндонуклеазой Hin6I (G↓CGC, место расщепления указано стрелкой), способной гидролизовать только неметилированную ДНК. Мы обнаружили, что исследуемые антибиотики и ионы Mg2+ не влияют на эффективность расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции (ЭР) Hin6I. Это позволило нам оптимизировать метод и проводить расщепление ДНК сразу после метилирования, без выделения метилированной ДНК и замены буферного раствора. После расщепления смеси анализировали в 20%-ном денатурирующем ПААГ. Для увеличения чувствительности метода успользовали ДНК-дуплекс 2 с двумя флуоресцентными FAM-метками. ДНК-дуплекс 2 расщеплялся с образованием 14-звенного FAM-меченного продукта. Для каждой концентрации антибиотика была рассчитана степень метилирования из соотношения расщепленной и нерасщепленной ДНК, была получена зависимость степени метилирования ДНК от концентрации оливамида. Мы обнаружили, что оливамид, как и оливомицин А, способен ингибировать реакцию метилирования. Значения IC50 для оливомицина А и оливамида составили 6±1 мкМ и 7,1±0,7 мкМ, соответственно. Из полученных данных можно сделать вывод, что исследуемые малобороздочные лиганды являются такими же эффективными ингибиторами Dnmt3a-CD, как и ранее изученный в нашей лаборатории димерный бисбензимидазол DB(11). Для того, чтобы определить, на какую стадию реакции метилирования оказывают влияние исследуемые препараты, мы изучили их действие на стадии образования фермент-субстратного комплекса и формирования ковалентного интермедиата. Первым шагом стало проведение комплексообразования ДНК-дуплекса 2 с Dnmt3a в присутствии различных концентраций оливамида. В этом эксперименте был использован метод поляризации флуоресценции в области флуоресценции FAM-метки, находящейся на 5’-конце ДНК-дуплекса. Связывание фермента с ДНК-дуплексом 2 определялось по изменению поляризации флуоресценции FAM при титровании субстрата МТазой Dnmt3a в присутствии оливамида и S-аденозил-L-гомоцистеина (аналог донора метильной группы S-аденозил-L-метионина). Константы диссоциации (KD) ДНК-белковых комплексов практически не изменялись при добавлении в реакционную смесь 5 или 15 мкМ оливомицина А или оливамида комплекса (KD = 95 ± 3 нМ в отсутствие оливамида и 115 ± 17 нМ в присутствии 15 мкМ оливамида). Таким образом, исследуемые антибиотики не приводили к значимому ухудшению связывания фермента с ДНК-субстратом. На примере оливомицина А было показано влияние малобороздочных лигандов на одну из ключевых стадий реакции метилирования ДНК: образование ковалентного интермедиата в результате нуклеофильной атаки положения С6 цитозина-мишени высококонсервативным остатком цистеина из активного центра С5-МТаз. Образующийся интермедиат нестабилен и быстро распадается с высвобождением продуктов реакции. Показано, что FAM-меченные ДНК-субстраты, содержащие остаток пиримидин-2-она (Z) вместо цитозина-мишени, образуют значительно более стабильные ковалентные интермедиаты с МТазами M.SssI и Dnmt3a, которые могут быть детектированы по флуоресценции FAM-метки в полиакриламидном геле. Поэтому нами были использованы 18-звенные ДНК-дуплексы, содержащие FAM-метку на 5'-концах и остаток Z, расположенный рядом с CG-сайтом. При введении оливомицина А в реакционную смесь перед добавлением МТазы ковалентный интермедиат не образовывался. Учитывая важность контактов Dnmt3a с малой бороздкой ДНК для протекания реакции метилирования, невозможность образования конъюгатов с Z-содержащей ДНК в присутствии оливомицина А может объясняться нарушением контактов каталитической петли Dnmt3a с группами атомов, экспонированными в малую бороздку. Это, в свою очередь, может приводить к затруднению протекания других стадий реакции метилирования, таких, как выведение цитозина-мишени из двойной спирали ДНК. Учитывая сходство структур оливамида и оливомицина А, было сделано предположение об аналогичном механизме влияния оливамида на протекание реакции метилирования ДНК. Возможность связывания антибиотиков группы АК с Dnmt3a-CD была изучена с помощью ряда методов на примере оливомицина А. Добавление Dnmt3a-CD к раствору оливомицина А не приводило к увеличению интенсивности флуоресценции при λвозб 550 нм, а исключение ионов Mg2+, необходимых для связывания исследуемых антибиотиков с ДНК, из реакционной смеси приводило к исчезновению ингибирующего эффекта оливомицина А. Эти факты позволяют сделать вывод о том, что влияние антибиотиков группы АК на метилирование не может объясняться их связыванием с Dnmt3a-CD. Суммируя все полученные результаты, можно сделать вывод о возможном эпигенетическом вкладе в механизм противоопухолевого действия антибиотиков группы АК, включающем ингибирование Dnmt3а. Результаты исследования легли в основу опубликованной статьи (“Биохимия”, 2019, 84(2), с. 229 – 239). 2. Кураксин CBL0137 Кураксин CBL0137 является представителем нового типа противораковых препаратов – производных карбазола. Согласно данным компьютерного моделирования, кураксин способен интеркалировать между парами оснований в ДНК, при этом положительно заряженная -NH-CH-(CH3)2-группа располагается в малой бороздке. В текущем году начаты исследования влияния кураксина на метилирование ДНК и комплексообразование Dnmt3a-CD с ДНК-субстратом. Согласно предварительным результатам, кураксин способен ингибировать метилирование ДНК с IC50 = 14±3 мкМ. Активность Dnmt3a-CD уменьшалась на 87% в присутствии высоких концентраций кураксина (60 мкМ). В процессе работы было также обнаружено ингибирование кураксином эндонуклеазы Hin6I, используемой для определения эффективности метилирования ДНК. В связи с этим, после метилирования ДНК-дуплекса 2 в присутствии кураксина проводили осаждение метилированной ДНК и замену реакционного буфера. Далее, при добавлении кураксина к раствору FAM-меченного ДНК-дуплекса нами было обнаружено увеличение поляризации флуоресценции FAM. Это, во-первых, подтверждает связывание кураксина с выбранным нами ДНК-дуплексом, и, во-вторых, позволит изучать влияние последовательности, длины и других характеристик ДНК-дуплекса на его связывание с кураксином. В следующем году предполагается дальнейшее исследование влияния кураксина на метилирование ДНК. 3. Мутантные формы Dnmt3a Участницей проекта Храбровой Д. А. были выделены мутантные формы мышиной Dnmt3a, соответствующие найденным мутантам Dnmt3a у пациентов при острой миелоидной лейкемии и других гематологических злокачественных заболеваниях. У полученных мутантных форм наблюдались нарушения тех или иных аспектов механизма ферментативной реакции, например, образования фермент-субстратного комплекса или выведения цитозина-мишени из двойной спирали ДНК. Эти свойства позволят нам использовать данные мутанты для изучения механизма действия оливамида и кураксина на способность Dnmt3a метилировать ДНК. | ||
2 | 20 марта 2019 г.-20 марта 2020 г. | Влияние противоопухолевых препаратов, связывающихся с ДНК, на функционирование ДНК-метилтрансферазы мыши Dnmt3a |
Результаты этапа: Кураксин (CBL0137) является перспективным производным карбазола, обладающим высокой противоопухолевой активностью и низкой токсичностью к здоровым клеткам [1]. Он способен интеркалировать в ДНК в AT-богатых участках. Ранее мы показали, что интеркалирующие лиганды способны ингибировать эукариотическую ДНК-метилтрансферазу (МТазу) Dnmt3a, осуществляющую de novo метилирование ДНК по 5 положению цитозина-мишени в CpG-участках [2]. Метилирование ДНК является важной формой эпигенетической регуляции и контролирует многие клеточные процессы. В данной работе исследовалось влияние CBL0137 на функционирование Dnmt3a как один из возможных аспектов его противоопухолевого действия. Мы исследовали связывание кураксина с 30-звенным ДНК-дуплексом, меченным 6-карбоксифлуоресцеином и содержащим один CpG-сайт (f-ДНК), а также комплексообразование каталитического домена Dnmt3a (Dnmt3a-CD) с f-ДНК в присутствии CBL0137. Было обнаружено взаимодействие CBL0137 с f-ДНК по увеличению поляризации флуоресценции f-ДНК при введении в анализируемую смесь CBL0137 (λвозб 495 нм, CBL0137 в этой области прозрачен). Константа диссоциации (KD) комплекса f-ДНК-CBL0137 составила 13±4 мкМ. Используя разработанный нами ранее метод определения эффективности метилирования ДНК in vitro [3], мы показали ингибирование реакции метилирования f-ДНК в присутствии CBL0137 с константой IC50, равной 14±3 мкМ. По предварительным данным, CBL0137 затрудняет образование комплекса f-ДНК с Dnmt3a-CD: KD фермент-субстратного комплекса составляла 80±9 нМ в отсутствие CBL0137 и >300 нМ при добавлении в раеакционную смесь 30 мкМ CBL0137. Результаты данной работы свидетельствуют о возможном эпигенетическом вкладе в механизм противоопухолевого действия кураксина CBL0137 и аналогичных препаратов. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".