ИСТИНА

Одной из важнейших задач современной тканевой инженерии является разработка биомедицинских изделий - скаффолдов, которые могут служить основой для пролиферации и дифференцировки клеток, а также поддерживают пространственную целостность органа, обеспечивая регенерацию утраченного или поврежденного органа или ткани. В процессе регенерации происходит формирование внеклеточного матрикса на поверхности скаффолда, в то время как сам скаффолд, используемый в качестве временного матрикса, впоследствии деградирует и биорезорбируется [1]. Разработка и получение таких скаффолдов является актуальной биомедицинской задачей, поскольку будет способствовать решению проблемы нехватки донорских органов при множестве широко распространенных заболеваний и травм, в том числе кожных покровов. Заживление кожных ран представляет собой последовательность межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий, формирующих каскад тесно связанных между собой событий: коагуляцию, воспалительную реакцию, синтез и накопление компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), миграцию и пролиферацию регенераторных клеток, неоваскуляризацию, реэпителизацию и репарацию (ремоделирование) [2]. Лечение глубоких травм и хронических кожных патологий, несмотря на развитие медицины, остается одним из самых сложных. Поэтому, разработка подхода, способствующего повышению качества регенерации кожных тканей при повреждениях различной этиологии, является актуальной задачей современной биологии и медицины. Одним из перспективных подходов к решению данной проблемы является использование мезенхимальных столовых клеток (МСК) для репарации кожных ран. Введение МСК в поврежденную область в значительной степени способствует заживлению благодаря широкому спектру паракринных факторов, секретируемых столовыми клетками в раневой области. Высокая смертность МСК и плохое приживление клеток в ишемических условиях, создающихся в ране, снижает эффективность подобной терапии [3] и заставляет искать подходы, повышающие регенеративную активность клеток при имплантации МСК в рану. В последнее время накапливается ряд данных, что культивирование МСК в трехмерных условиях - в сфероидах и на биоскаффолдах - пролонгирует выживаемость имплантированных МСК и повышает их паракринную активность [4]. Это связано с тем, что в плоской 2D культуре клетки теряют естественную организацию и связи с экстрацеллюлярным матриксом и другими компонентами ткани, а в 3D культуре нарушенная организация взаимодействия клетка-матрикс частично восстанавливаются, что служит повышению функциональной активности клетки. Таким образом, вопрос создания эффективных биорезорбируемых субстратов, поддерживающих оптимальную функциональную активность МСК за счет трехмерного культивирования и служащих носителями для доставки МСК в раневую область, безусловно, является актуальным.

One of the most important tasks of modern tissue engineering is the development of biomedical products - scaffolds, which can serve as a base for cell proliferation and differentiation; in addition, they maintain the spatial integrity of the organ, providing regeneration of the lost or damaged organ or tissue. In the process of regeneration, the extracellular matrix is formed on the scaffold surface, whilst the scaffold itself, used as a temporary matrix, is subsequently subjected to degradation and bioresorption processes [1]. The development and production of such scaffolds is a topical biomedical task, as far as it may help to solve the problem of the lack of donor organs in a number of widespread diseases and injuries, including trauma of the skin. Skin wound healing consists of the sequence of inter-cellular and matrix – cellular interactions, that initiate cascade of interconnected events: coagulation, inflammatory reaction, synthesis and accumulation extracellular matrix (ECM), migration and proliferation of regenerative cells, neovasculanization, reepitalization and reparation [2]. Despite recent medical advances, the problem of healing of deep wounds and chronic skin pathologies continues to be very complex. Therefore, the development of approaches that help to increase the quality of skin tissue regeneration is an important issue for the current biology and medicine. One of the promising approaches to solving this problem is using mesenchymal stem cells (MSC) for skin wound reparation. Introduction of MSC into the damaged area largely helps healing because these stem cells secrete wide spectra of paracrine factors. High mortality of MSC in ischemic conditions in the wound decrease efficiency of such therapy [3] and stimulate us to seek approaches to increase regenerative ability of the cells implanted in the wound. The is evidence that MSC cultivation in 3D conditions – on spheroids and bioscaffolds prolongs survival of implanted MSC and increase their paracrine activity [4]. This is due to the fact that in 2D culture cells lose natural organization and connection with extracellular matrix and other tissue components, whereas in 3D culture damaged organization of cell – tissue interaction in partially recovered, causing elevation of functional cell activity. Therefore, creating effective 3D bioresorbing substrates that support optimal MSC function and serve as carriers for delivering MSC into wound area is very important for current medicine.

В результате выполнения проекта будет выделена и охарактеризована первичная культура мышиных МСК из костного мозга с применением как иммунофлуоресценции путем выявления специфических поверхностных маркеров, включая CD44, CD90, CD31 и CD45, так и молекулярно-биологическими методами путем оценки уровня экспрессии генов-маркеров. Будут получены микроносители из фиброин-желатина с заданными размерами (100-250 мкм) и исследованы особенности роста и показаны направления дифференцировки МСК на фиброин-желатиновых микроносителях и коммерчески доступном микроносителе из желатина CultiSpher-S, который представляет собой пористые шарики, пригодные для культивирования адгезионных клеточных культур [1]. Для проверки направления дифференцировки будут использованы гистохимические и биохимические методы, в том числе с использованием нильса красного, судана черного, альцианового синего и ализаринового красного. Будут получены данные по влиянию состава и микроструктуры микроносителя (фиброин-желатин и CultiSpher-S ) на скорость миграции МСК. Для этого будет создана и отработана модельная система исследования миграции клеток между частицами микроносителей с применением КЛСМ. Будет отработана модель шинированных полнослойных кожных ран мыши и исследовано влияние введения микроносителей и витализации их МСК на динамику заживления полнослойной раны кожи мыши по морфометрическим данным и полноту и особенности регенерации полнослойной раны кожи мыши при введении микроносителей с препятствием контракции раны путем наложения силиконовых шин. Шинирование ран – наложение силиконовых колец, зафиксированных на коже узловыми швами, необходимо для предотвращения быстрой контракции раны, которая обусловлена особенностями анатомического строения мышиной кожи, а именно наличием подкожной мышцы (panniculus carnosus). По итогам выполненных работ будут подготовлены 2 публикации в журналах, индексируемых в WoS и/или Scopus. Полученные в ходе выполнения данные могут являться основой для разработки инъекционной формы препарата, ускоряющего заживление и стимулирующего регенерацию в области повреждения, а также для разработки технологий клеточной терапии, основанной на доставке выращенных in vitro клеток, участвующих в регенерации ран. Кроме того, на основе полученных данных могут быть разработаны модельные системы in vitro для исследования молекулярных и клеточных механизмов регенеративной активности МСК.

Научный коллектив имеет многолетний опыт исследований в области регенеративной медицины и тканевой инженерии, а также разработок новых биоискусственных материалов и изделий на их основе. Ранее, в ходе выполнения различных НИР, поддержанных Минобрнауки РФ и РФФИ, а также в инициативном порядке была создана панель скаффолдов на основе структурных белков шелка и компонентов ВКМ в виде пленок, пористых структур, трубок, гибридных конструкций и мирочастиц. Исследованы физико-химические особенности полученных скаффолдов, показана их биосовместимость в моделях in vitro, в том числе с использованием первичных культур клеток, участвующих в регенерации. Продемонстрирована способность микроносителей поддерживать адгезию и пролиферацию различных типов клеток, что является важным показателем возможности их применения для клеточной терапии. Показано, что созданные конструкции на основе фиброина шелка и спидроина стимулируют регенерацию различных тканей и органов, в том числе восстановление костной ткани, стенки тощей кишки и кожи в модели полнослойной раны кожи мыши. Проведенные исследования влияния введения микроносителей на заживление полнослойной кожной раны, позволили установить, что применение микрочастиц замедляет контракцию раны в первые дни заживления и, в итоге, стимулирует полную регенерацию всех слоев кожи. Замедление контракции может быть вызвано дополнительной активацией факторов воспаления. Исследования скорости заживления и полноты регенерации кожных ран при введении фибрионовых и фиброин-желатиновых микрочастиц проводились на модели полнослойной раны кожи мыши, широко используемой исследователя. Однако данная модель имеет серьезный недостаток: существенный вклад в заживление полнослойной раны кожи мыши вносит контракция раны, обусловленная особенностями анатомического строения мышиной кожи, а именно наличием подкожной мышцы (panniculus carnosus), что приводит к быстрому затягиванию раны.