ИСТИНА

Проект направлен на детальное изучение изменений компонентов электронной транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий при воспалительных процессах и нарушениях метаболизма. Митохондрии являются участниками ключевых процессов метаболизма клеток: катаболизма и анаболизма углеводов и липидов, продукции АТФ. Эффективность данных процессов зависит от функционального состояния митохондрий. Также от этого зависит инициация апоптоза и продукция активных форм кислорода (АФК), вызывающих окислительный стресс, что вовлекает митохондрии в развитие воспалительных процессов. Функционирование митохондрий определяется состоянием ее ЭТЦ, в частности, редокс-состоянием и конформацией ключевых переносчиков электронов ЭТЦ – цитохромов. Спектроскопия комбинационного рассеяния света (КР) позволяет исследовать конформацию и редокс-состояние цитохромов а-, b- и c-типов в ЭТЦ интактных изолированных митохондрий и в митохондриях внутри живых клеток. В ходе Проекта будут разработаны и применены новые методические подходы на основе спектроскопии КР для неинвазивного детального исследования митохондрий, липидов и белков живых и фиксированных клеток. Будут исследованы изменения свойств цитохромов митохондрий, липидов и белков, происходящие при воспалительных процессах в стволовых клетках и при развитии ожирения и инсулиновой резистентности в скелетных мышечных клетках. Детальное неинвазивное исследование состояния отдельных компонентов ЭТЦ митохондрий при различных патологических процессах и их взаимосвязь с метаболизмом липидов и углеводов необходимо для глубокого понимания механизмов развития заболеваний, что в перспективе может послужить основой для разработки новых диагностических методов и терапевтических агентов.

The aim of the Project is to perform detailed study of changes in the components of the electron transport chain (ETC) of mitochondria upon inflammatory processes and metabolic disorders. Mitochondria participate in the key processes of cell metabolism: catabolism and anabolism of carbohydrates and lipids, ATP production. The effectiveness of these processes depends on the functional state of the mitochondria. It also affects the initiation of apoptosis and the production of reactive oxygen species (ROS), which cause oxidative stress, which implicates mitochondria in the development of inflammatory processes. The functioning of mitochondria is determined by the state of its ETC, in particular, the redox state and the conformation of the cytochromes, key electron carriers of ETC. Raman spectroscopy (RS) allows to study the conformation and redox state of cytochromes of a, b and c types in the ETC in intact isolated mitochondria and mitochondria inside living cells. During the Project new methodical approaches based on RS for non-invasive detailed studies of mitochondria, lipids and proteins of living and fixed cells will be developed and applied. Changes in the properties of cytochromes in mitochondria, lipids and proteins that occur upon inflammation in stem cells and the development of obesity and insulin resistance in skeletal muscle cells will be investigated. A detailed noninvasive study of the state of the individual components of the mitochondrial ETC during various pathological processes and their relationship with the metabolism of lipids and carbohydrates is necessary for a deep understanding of the mechanisms underlying disease development, which in future can serve as a basis for the development of new diagnostic methods and therapeutic agents.

1) Новые данные о количестве, конформации и редокс-состоянии гемов цитохромов ЭТЦ митохондрий в стволовых клетках при индукции воспаления. Ингибиторный анализ позволит выявить наиболее чувствительные к воспалению участки ЭТЦ митохондрий и предположить вероятные механизмы продукции АФК; 2) Данные о конформации и редокс-состоянии гема цитохрома С в изолированных митохондриях при ингибиторном анализе и данные о конформации гема цитохрома С при взаимодействии с различными липидами; 3) Установить взаимосвязь между функциональным состоянием митохондрий и отдельных компонентов ЭТЦ (цитохромов и железо-серных кластеров) и метаболизмом липидов, а также липидным составом липидных капель скелетных миоцитов при развитии ожирения и инсулиновой резистентности; 4) Разработать новые методические подходы на основе спектроскопии КР для неинвазивного детального исследования отдельных комплексов ЭТЦ митохондрий, а также липидов и белков в живых и фиксированных клетках. Полученные нами данные позволят понять фундаментальные аспекты функционирования отдельных комплексов ЭТЦ митохондрий в целых клетках при воспалительных процессах и нарушениях метаболизма. Разработанный подход может найти широкое применение для исследования фундаментальных процессов, происходящих в митохондриях in situ, для разработки новых методов диагностики воспалительных процессов и нарушения метаболизма, а также для тестирования лекарственных препаратов.

Никельшпарг Э.И. участвовала в разработке методики селективного определения редокс-состояния цитохрома С в функционирующих митохондриях, помещенных на плазмонные наноструктуры серебра, на основе спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния [1] и исследовала свойства различных наноструктур в применении к митохондриям, эритроцитам, липидам и белкам [2]. На данную тему ею была также опубликована научно-популярная статья [3]. Никельшпарг Э.И. имеет статью с первым эквивалентным авторством по итогам разработки методики исследования скелетных миоцитов с использованием КР спектроскопии в ближней ИК-области при исследовании материала от пациента, страдающего морбидным ожирением и инсулиновой резистентностью до и после операции, ограничивающей количество потребляемых калорий [4]. Глуханюк Е.В. занимает научную ставку в лаборатории трансплантационной иммунологии и иммунотерапии гемобластозов и работает врачом в отделении лечения и реабилитации пациентов иммуногематологического профиля и реципиентов стволовых клеток НМИЦ ДГОИ им Д.Рогачева. Работа Глуханюка Е.В. была посвящена изучению механизмы про- и антивоспалительного действия факторов VEGF, HGF, в том числе при их комбинированном действии. Работа [5] посвящена изучению влияния экспрессии микро-РНК miR-92a на ангиогенные свойства мезенхимальных стромальных клеток, полученных из жировой ткани (МСК ЖТ); работа [6] посвящена использованию МСК ЖТ для создания минимальных тканеинжененрных конструкций для потенциальной терапии ишемических заболеваний. 1. Brazhe Nadezda A. et al. (2015) Scientific reports, 5: srep13793. 2. Sarycheva Asia S et al. (2016) Journal of Materials Chemistry, 4(3): 539–546. 3. Никельшпарг Э.И. (2016) Природа, 3: 17-25. 4. Nadezda A. Brazhe*, Evelina I. Nikelshparg* et al. (2017) J. Raman Spectroscopy. 5. Natalia Kalinina et al. (2015) Experimental Cell Research 339(1): 61-66. 6. Pavel I. Makarevich et al (2015) Stem Cell Research & Therapy 6(204)

I. Состояние цитохромов митохондрий в живых клетках при индукции воспаления I.1. Воспаление, индуцированное провоспалительными цитокинами Мы разработали подход для исследования количества и редокс-состояния цитохромов митохондрий в живых клетках методом комбинационного рассеяния света (КР). Для этого использовали прогениторные клетки слизистой ротовой полости OMLP-PCs (Oral mucosal lamina propria progenitor cells). Для исследования свойств цитохромов С, С1 и В (в комплексах II и III ЭТЦ) было использовано возбуждение с длиной волны 532 нм. Данная длина волны является резонансной для исследования цитохромов типа b и с, но не цитохромов А. Все эксперименты выполняли на микроспектрометре фирмы Ренишау (Великобритания), совмещенном с прямым микроскопом фирмы Leica. Для микроспектроскопического исследования стволовых клеток клетки культивировали в чашках Петри со стеклянным дном в питательной среде рН 7,2 (DMEM с высокой глюкозой, 2мM L-глутамин, 100 МЕ/мл пенициллина, 10% инактивированная фетальная бычья сыворотка FCS) и инкубировали при 37°C/5% CO2 до достижения 50% конфлюэнтности. После этого чашки с клетками переносили под микроспектрометр и регистрировали спектры КР живых клеток в клеточной среде. Каждый пик на спектре КР соответствует колебаниям определенных групп атомов в молекуле: 746 и 1126 см-1 – колебаниям связей в гемах (основной вклад вносит гем С и В, соотвественно), 1000 см-1 – фенилаланин в белках, 1450 – C-H2 связи в липидах и белках и 1655 – колебания двойных С=С связей. Так как основной вклад в сигнал КР вносят восстановленные формы цитохромов [1], мы применили к клеткам химический восстановитель – дитионит натрия (SDT), чтобы восстановить все цитохромы и таком образом оценить общее количество цитохромов. Пики цитохромов на спектре КР клеток после восстановления значительно выше, чем на интактных клетках. С помощью данного подхода мы можем оценить относительное количество восстановленных цитохромов в живой клетке. Для исследования соотношения относительного количества цитохромов разного типа и насыщенных и ненасыщенных липидов мы предлагаем использовать следующие соотношения интенсивностей пиков: I746/I746sdt – для определения количества восстановленных цитохромов С относительно общего количества цитохромов С, аналогичный параметр для цитхромов типа В: I1126/I1126sdt, I746/I1126 – относительное количество восстановленных цитохромов С к восстановленным цитохромам В, I746sdt/I1126sdt – относительное количество цитохромов С к цитохромам В, а также I1655/I1450 – количество ненасыщенных липидов по отношению к насыщенным липидам и белкам. Мы исследовали воспаление, индуцированное фактором некроза опухоли TNFα и интерфероном IFNγ, на клеточной модели. В работах [5–7] показано, что воспаление, индуцированное данными цитокинами, приводит к изменению метаболизма клеток, морфологии митохондрий и повышенному образованию активных форм кислорода (АФК). Таким образом, мы пытались выяснить, какое влияние провоспалительные факторы оказывают на состояние цитохромов митохондрий. Для индукции воспаления добавляли по 1 мкл провоспалительных факторов: (1) 100 МЕ/мл человеческого рекомбинантного интерферона IFNγ или (2) 0,1 мкг/мл человеческого рекомбинантного фактора некроза опухоли TNFα, к контрольной группе (3) добавляли 1 мкл клеточной среды. Клетки инкубировали 3 дня при 37°C/5% CO2 без смены среды. Необходимо учитывать, что при развитии воспаления очень важно, какой именно временной промежуток исследуется. Так, в работе [8] показано, что действие TNF после 96 часов противоположно его действию после 24 часов. Мы исследовали эффект через 72 часа, так как это наиболее релевантная модель хронического воспаления. Используя описанный подход, мы оценили относительное количество цитохромов типа В и С в условиях индукции воспаления различными провоспалительными факторами. Мы наблюдаем достоверное увеличение в 1,6 раз относительного количества восстановленного цитохрома В без изменений в цитохроме С в клетках при действии TNFα. При этом соотношение общего количества цитохромов типа С и В не отличается от контроля. Ранее мы наблюдали этот эффект (двукратное увеличение восстановленных цитохромов В без изменений в цитохроме С) в миоцитах пациентов при ожирении и метаболических нарушениях [9]. Пул хинонов во внутренней мембране митохондрий получает электроны от 3 основных источников: комплексов I и II ЭТЦ и одного из ферментов окисления ЖК – электрон-переносящиего флавопротеина (ETF) [10]. При избыточном поступлении электронов на пул хинонов посредством ETF может происходить ингибирование Q-цикла, т.к. предположительно может наблюдаться недостаточное количество окисленных хинонов (Q), способных принять электрон от цитохрома В, вследствие чего цитохромы В комплекса III будут оставаться в восстановленном состоянии, что и мы и наблюдаем. Кроме того, это может повысить вероятность того, что семихинон (Q*) будет долго оставаться связанным с комплексом III, что повышает вероятность генерации АФК. При этом может происходить обратный перенос электронов из пула хинонов на комплекс I и II, что также вызывает повышенное образование АФК. В случае индукции воспаления IFNγ наблюдается другая картина. Продемонстрировано, что IFNγ вызывает увеличение относительного количества восстановленных цитохромов обоих типов при сохранении их соотношения, что согласуется с литературными данными о том, что при действии интерферона снижается степень разобщенности переноса электрона и окислительного фосфорилирования [11]. Доля восстановленных цитохромов В по отношению к восстановленным цитохромам С больше при индукции воспаления TNFα и меньше при индукции интерфероном. Также мы зафиксировали снижение относительного количества ненасыщенных липидов при индукции воспаления IFNγ, но не TNFα. Таким образом, с помощью разработанного нами подхода на основе спектроскопии КР мы показали, что воспаление, индуцированное по разным механизмам, может оказывать различное влияние на митохондрии в клетках. Изменения состояния цитохромов при воспалении, индуцированном TNFα, схожи с наблюдаемыми изменениями в скелетных мышцах при наличии метаболического синдрома [9], но отличны от реакции на IFNγ. Предложен механизм, объясняющий наблюдаемые эффекты на уровне отдельных комплексов ЭТЦ митохондрий. Данные представлены на международной конференции 20th European Bioenergetics Conference (EBEC), Будапешт, Венгрия, 25-30 августа 2018 (стендовый доклад) и на VI Съезде Биофизиков России, Сочи, Россия, 16-21 сентября 2019 (стендовый доклад). I.2. Реакция на окислительный стресс при воспалении Определение редокс-статуса цитохромов В и С в живых клетках В ответ на провоспалительные стимулы нейтрофилы производят два основных оксиданта: хлорноватистую (HOCl) и гипотиоциановую кислоту (HOSCN). Известны бактерицидные свойства данных оксидантов. Кроме этого, они также оказывают влияние на собственные клетки организма, в первую очередь на макрофаги, стимулируя выработку провоспалительных цитокинов [12]. При этом, механизмы воздействия на метаболизм макрофагов до конца не изучены. В работе [13] показано, что данные оксиданты могут вызывать переход с окислительного на гликолитический метаболизм макрофагов, что не может не сказаться на функционировании митохондрий. Мы получили предварительные результаты влияния HOSCN на состояние электрон-транспортной цепи макрофагов. Культуру макрофагов (J774A.1) выращивали аналогично прогениторным клеткам OMLP-PCs. Окисдант HOSCN добавляли до конечной концентрации 200 мкM и исследовали клетки после 60 минутной инкубации. Концентрации подбирали таким образом, чтобы не происходили морфологические изменения в клетках, но при этом наблюдались физиологические эффекты. Мы зарегистрировали спектры КР макрофагов. Так как клетки J774A.1 имеют большую толщину и концентрацию митохондрий по сравнению с OMLP-PCs, их спектры КР более интенсивны. Однако набор пиков на спектрах практически идентичен. Для анализа редокс-состояния цитохромов митохондрий мы рассчитывали соотношения пиков на спектрах КР: I747/I1003 или I747/I1660 – количество восстановленных цитохромов типа С и В по отношению к количеству остатков фенилаланина или пептидных связей, соответственно. Оба соотношения позволяют оценить относительное количество восстановленного цитохромов типа С к общему содержанию белков; I1124/I1003 или I1124/I1660 - количество восстановленных цитохромов типа С и В по отношению к количеству остатков фенилаланина или пептидных связей, соответственно. Оба соотношения позволяют оценить относительное количество восстановленного цитохромов типа В к общему содержанию белков; (I747/I1003)SDT или (I747/I1660)SDT – количество цитохромов типа С (окисленных и восстановленных) относительно содержания белков; (I1124/I1003)SDT или (I1124/I1660)SDT - количество цитохромов типа В (окисленных и восстановленных) относительно содержания белков; I747/I1124 – соотношение количества восстановленных цитохромов типа С и В; (I747/I1124)SDT- соотношение общего количества цитохромов типа С и В; I1445/I1660 - соотношение содержания липидов и белков. Мы обнаружили, что относительные количества восстановленных цитохромов С и В-типа, нормированные на общее содержание белка, значительно снижаются в клетках после применения HOSCN. Этот результат может быть обусловлен окислением цитохромов ЭТЦ при применении HOSCN или может свидетельствовать о начале разрушения митохондрий. Мы наблюдали тенденцию к уменьшению количества всех цитохромов С- и В-типа в клетках после обработки HOSCN по сравнению с контрольными клетками, что могло быть результатом частичного разрушения митохондрий и уменьшения количества митохондрий. Мы не наблюдали разницы в соотношении цитохромов типа В и С (как только восстановленных форм, так и всех форм), что свидетельствует об отсутствии избирательного окислительного действия HOSCN на определенный тип цитохрома. Не было выявлено значительного различия между относительным количеством липидов по отношению к белкам в клетках после обработки HOSCN, что указывает на отсутствие сильного окисления компонентов клетки с помощью HOSCN. Поскольку митохондрии распределены неравномерно внутри клеток, и поскольку любой окислитель может потенциально воздействовать на митохондрии по-разному в зависимости от их расположения внутри клетки, мы провели КР-картирование нескольких клеток, вычислили спектроскопические параметры, характеризующие относительное количество цитохромов и белков, и составили соответствующие карты распределения цитохромов и белков в клетке. КР-изображения были проанализированы с помощью разработанного программного обеспечения Pyraman [14] на основе алгоритма, описанного в [15]. Базовую линию вычитали в каждом спектре. Среднеквадратичное значение (root means square, RMS) рассчитывалось для интенсивности спектра КР в определенных частотных диапазонах: 740-750 см-1 для цитохрома С, 995-1005 см-1 для белка и 780-790 см-1 для цитозина. Значения были нормированы на среднеквадратичное значение области без каких-либо пиков 500-540 см-1 (спектральный фоновый шум). Действительно, оказалось, что митохондрии расположены неравномерно в макрофагах, что видно по неоднородному распределению значения, характеризующего относительное количество восстановленных цитохромов С-типа (нормализованное по спектральному фоновому шуму и относительному количеству белков) в макрофагах до и после добавления HOSCN и последующего применения SDT. Кроме того, мы показали, что HOSCN приводил к уменьшению интенсивности «цитохромных» пиков (нормализованных по спектральному фоновому шуму и относительному количеству белков) в клетке, что свидетельствует о частичном окислении цитохромов ЭТЦ. Применение SDT значительно увеличивает интенсивность пиков цитохромов во всех клеточных областях, однако самые яркие области (области с наибольшим количеством цитохромов и митохондрий) не перекрываются с самыми яркими областями в клетке до применения SDT. Этот результат может быть связан с перераспределением митохондрий внутри клеток под действием HOSCN и/или SDT и неравномерным изменением их активности. Таким образом, мы предлагаем подход на основе спектроскопии КР для количественной оценки цитохромов типа В и С в восстановленном состоянии и обеих редокс-формах. С помощью данного подхода мы продемонстрировали, что HOSCN приводит к окислению цитохромов митохондрий и также, предположительно, к их деградации и перераспределению внутри клетки. Данные представлены на конференции «Живые системы» (24-26 сентября 2019, Саратов, Россия). II. Изменения конформации гема цитохрома С в митохондриях и липосомах при различных воздействиях II.1. Изменения конформации гема цитохрома С в митохондриях при модуляции активности электронного транспорта и величины потенциала на внутренней мембране Спектр резонасного КР окисленных цитохромов существенно менее интенсивный, чем спектр восстановленных цитохромов. Поэтому все измерения спектров и изображений КР на клетках позволяют исследовать только восстановленные формы цитохромов. Чтобы провести детальное исследование конформационных изменений окисленного гема С цитохрома С в митохондриях, мы использовали спектроскопию гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) на наноструктурах серебра. Наноструктуры были получены по методике, описанной в [16]. Ранее мы показали, что помещение митохондрий на данные наноструктуры вызывают значительное усиление сигнала КР селективно от цитохрома С, но не других цитохромов, в интактных функционирующих митохондриях [17]. Используемые наноструктуры не влияли на целостность мембран митохондрий и их функциональную активность [17]. Мы регистрировали интенсивный спектр ГКР митохондрий, помещённых на плазмонные наноструктуры, при возбуждении лазером с длиной волны 514 нм. Спектр ГКР митохондрий обладает рядом интенсивных пиков: 1127, 1170, 1300-1371, 1547, 1570 и 1638 см-1. При этом, при тех же параметрах регистрации спектра ни митохондрии без наноструктур, ни наноструктуры в буферном растворе не обладают спектрами ГКР. Известно, что при используемых длинах волн возможно регистрировать сигнал только от цитохромов типа В и С, но не от цитохромов типа А [1]. Спектр ГКР митохондрий совпадает со спектром ГКР окисленного цитохрома С. Следует заметить, что на спектрах ГКР митохондрий отсутствуют пики восстановленного цитохрома С. Наиболее значительные изменения в спектрах ГКР при восстановлении цитохрома – это смещение пика 1371 см-1 в положение 1356 см-1 и значительное уменьшение интенсивности пика 1638 см-1. Также на спектре ГКР митохондрий отсутствует пик 1338 см-1, характерный для цитохромов типа В, что свидетельствует об отсутствии вклада цитохромов В-типа в ГКР-спектр митохондрий. Чтобы дополнительно установить происхождение пиков на спектре, мы регистрировали спектры ГКР от субмитохондриальных частиц (СМЧ), помещенных на наноструктуры. СМЧ представляют собой везикулы из вывернутой внутренней мембраны митохондрий с комплексами ЭТЦ. Внутри везикул находится содержимое ММП митохондрий с цитохромом С [18]. На спектрах ГКР СМЧ присутствуют пики от окисленного цитохрома типа С, но, в отличие от спектра ГКР митохондрий, на спектре ГКР СМЧ также обнаружены пики цитохромов В-типа (1338 см-1) и С-типа в восстановленной форме (1356 см-1). По различным теоретическим и экспериментальным оценкам максимальное расстояние от плазмоных поверхностей, на котором удается получить усиление сигнала от молекул, составляет не более 10-15 нм (Ray et al. 2007; Wokaun et al. 1983; Moskovits 1978; Еремина и др. 2018). Мы предполагаем, что из-за пространственной организации ММП и внутренней мембраны митохондрий только окисленный цитохром С может оказываться на таком расстоянии от поверхности наноструктур. Остальные переносчики ЭТЦ, включая восстановленный цитохром С, цитохром С1, цитохром В, расположены на большем удалении от поверхности СНС, следовательно, сигнал ГКР от них не регистрируется. В работе [17] нами были показано, что конформация гема цитохрома С меняется в ответ на изменение потенциала на внутренней мембране митохондрий (ΔΨ), что достигалось добавление разобщителя синтеза АТФ и электронного транспорта – протонофора СССР (что вызывало уменьшение ΔΨ и содержания протонов в ММП) и ингибитора АТФ-синтазы олигомицина (что вызывало увеличение ΔΨ и содержания протонов в ММП). В настоящей работе мы исследовали конформационные изменения в геме цитохрома С при появлении калиевых токов через мембрану митохондрий. Это достигалось внесением валиномицина (переносчика ионов калия) к работающим митохондриям. Митохондрии получали из сердец самцов крыс линии WKY по разработанной ранее методике [17]. Исследование одобрено комиссией по биоэтке МГУ (протокол №82-O). Во время работы митохондрий увеличивается мембранный потенциал на внутренней мембране митохондрий (ΔΨ). В функционирующих митохондриях валиномицин переносит ионы калия из ММП в матрикс, что вызывает значительную деполяризацию мембраны (снижение ΔΨ) [23]. Мы обнаружили, что при добавлении валиномицина к работающим митохондриям вероятность плоской конформации гема цитохрома С увеличивалась, что наблюдали по увеличению соотношения I1638/I1371. На окислительно-восстановительное состояние и жесткость белкового окружения это не влияло, что видно по отсутствию изменений соотношений I1170/I1371 и I1170/I1127. В неработающих митохондриях в отсутствие субстратов, при низкой величине разности потенциалов на внутренней мембране, валиномицин не приводил к изменениям в спектре ГКР. Данные результаты согласуются с работой [24], где было показано снижение I1638/I1371 в спектрах ГКР изолированного цитохрома С для тех мутантов цитохрома С, которые хуже акцептировали электрон от комплекса III и хуже переносили его на комплекс IV. Данные представлены на международной конференции Biomembranes'2018, Долгопрудный, Россия, 1-5 октября 2018 (стендовый доклад). Для более детального исследования митохондрий при разных воздействиях (субстраты, АДФ, СССР, валиномицин, олигомицин) мы регистрировали флуоресценцию потенциал-чувствительного зонда MitotrackerCMXRos, интенсивность флуоресценции которого обратно пропорциональна величине ΔΨ. Оказалось, что соотношение I1638/I1371 возрастает при снижении ΔΨ, что достигается добавлением валиномицина или переносчика протонов – СССР. Иными словами, при деполяризации мембраны вероятность плоской конформации гема цитохрома С возрастает, а при гиперполяризации мембраны, наоборот, – снижается. II.2. Изменения конформации гема цитохрома С в липосомах при изменении потенциала на мембране Однако активация электронного транспорта, ровно как и действие валиномицина, может вызывать различные изменения в митохондриях, такие как набухание матрикса, сближение внутренней и внешней мембраны митохондрий, переход связанного на мембране кальция в растворенную форму и т.д. Все это может оказывать влияние на цитохром С. Чтобы выявить влияние исключительно ионного тока через мембрану на конформацию гема цитохрома С, мы провели аналогичное исследование на липосомах с цитохромом С. Была разработана технология приготовления протеолипосом нужного состава. Протеолипосомы готовили, основываясь на методике [25], но со значительными модификациями. Известно, что цитохром С взаимодействует с кардиолипином внутренней мембраны митохондрий. Для того, чтобы цитохром С так же взаимодействовал с мембраной липосом, мы готовили липосомы из фосфатидилхолина (основного липида клеточных мембран) и кардиолипина (составляющего до 20% митохондриальных мембран). Фосфатидилхолин (ФХ, Sigma-Aldrich) из яичного желтка и кардиолипин (КЛ, Avanti Polar Lipids) из бычьего сердца в соотношении 4:1 по массе растворяли в хлороформе до концентрации липидов 10 мг/мл. Хлороформ испаряли в вакуумном роторном испарителе 30 минут при 30 oC. Липидную пленку гидратировали раствором цитохрома С из сердца лошади (Sigma Aldrich) 5 мг/мл в буфере, содержащем 50 мМ Трис*Cl, 0.1 мМ ЭДТА (рН 7.4) 30 минут при 30 oC. В качестве контроля готовили липосомы без цитохрома С с тем же буфером. Так как цитохром С может образовывать комплексы с кардиолипином, то после гидратации применяли ультразвуковую гомогенизацию. После этого суспензию подвергали 7 циклам замораживания-оттаивания и пропускали через экструдер (Avanti Mini-Extruder) с диаметром пор 100 нм. К полученным липосомам добавляли концентрированный раствор KCl до конечной концентрации 100 мМ. Внешний цитохром С отмывали на хроматографической колонке с применением Sephadex G150 в буфере, содержащем 50 мM Tрис-Cl, 0.1мM ЭДТA, 100 мM KCl (pH 7.4). Так как цитохром С способен образовывать прочные комплексы с кардиолипином, некоторое количество цитохрома С содержалось на внешней стороне липосом. Концентрация внутреннего цитохрома С составляла в среднем 4.3 µM, наружного – 2.2 µM. Мы впервые зарегистрировали спектры ГКР липосом с цитохромом С внутри и получили усиление от гема цитохрома С. Спектр липосом оказался идентичен спектру митохондрий и изолированного цитохрома С. Приготовление липосом осуществлялось в буфере без калия, тогда как во внешней среде концентрация калия 100 мМ, следовательно, на мембране липосом есть разность потенциалов. Валиномицин вызывает ток калия внутрь липосом и исчезновение мембранного градиента. При этом зафиксировано увеличение подвижности гема цитохрома С, что наблюдается по увеличению соотношения I1638/I1371 на спектрах ГКР, аналогично тому, что происходит в митохондриях. Стоит отметить, что увеличение разности потенциалов само по себе не дает никакого эффекта. Если цитохром С добавлен к липосомам только снаружи, также не наблюдается влияния мембранного потенциала на конформацию его гема. Эффект наблюдается только при внесении валиномицина к липосомам, содержащих цитохром С внутри, то есть только при появлении тока ионов через мембрану. Сам по себе изолированный цитохром С в растворе не чувствителен к разной концентрации калия. Исходя из результатов данного эксперимента, мы предполагаем, что наиболее важным фактором изменения конформации гема цитохрома С является появление ионного тока через мембрану. III. Исследование состава и конформации липидов в клетках, митохондриях и липосомах В представленной работе основной акцент был сделан на исследовании гемовых белков, в первую очередь, цитохрома С в митохондриях. Однако не менее важно учитывать свойства липидных мембран митохондрий и клеток. Мы продемонстририровали возможности спектроскопии ГКР в изучении конформации липидов в искусственных и интактных биологических мембранах. Ранее конформация липидов в клетках и мышечных липидных каплях исследовали методом КР, в том числе в нашей группе [4,9], а также методом ГКР на моно- и бислоях липидов и гибридных липидных пленках [26,27]. Однако мы впервые провели исследования липидов в интактных клетках и митохондриях методом ГКР на плазмонных наноструктурах. Для этого мы использовали следующие препараты: (1) митохондрии сердца крысы, (2) тени эритроцитов (везикулы, состоящие из плазматической мембраны эритроцитов с примембранным гемоглобином (Гб) и примембранным цитоскелетом без цитозольного Гб), полученные, как описано [28]; (3) липосомы, полученные из фосфатидилхолина яичного желтка (ФХ) и кардиолипина бычьего сердца (КЛ), как описано выше; и (3) протеолипосомы из ФХ (80 %wt) и КЛ (20 %wt) с цитохромом С внутри. Для проведения измерений ГКР 300 мкл суспензии добавляли к AgNSS, помещенным в чашку Петри со стеклянным дном, и затем регистрировали спектры ГКР с нескольких мест, используя объектив 20 × NA 0,4 и время накопления 20 с. Мощность лазера составляла 1-5 мВт на место регистрации, что не повреждало данные объекты. Спектры ГКР митохондрий и теней эритроцитов в низкочастотном диапазоне (600-1800 см-1) при лазерном возбуждении 514 нм соответствуют спектрам ГКР гемов С в цитС и гемов В в примембранном Гб, соответственно. Используя данный спектральный диапазон, мы можем исследовать конформационные изменения гемов внутри клеток и органелл. Липиды не вносят вклад в этот спектральный диапазон, что может быть объяснено перекрытием их низкоинтенсивного сигнала ГКР более интенсивным ГКР гемсодержащих белков. Однако мы продемонстрировали, что используемые наноструктурированные поверхности обеспечивают усиление КР липидов в митохондриях и мембранах эритроцитов в высокочастотном диапазоне (2700-3100 см-1). Спектры ГКР митохондрий и теней эритроцитов содержат три интенсивных пика с положениями максимумов: 2875, 2930 и 2960 см-1. Мы полагаем, что спектры ГКР митохондрий в основном определяются наружной митохондриальной мембраной, поскольку она располагается ближе к AgNSS, чем внутренняя мембрана, а усиление ГКР в значительной степени зависит от расстояния между наноструктурами и аналитом. Согласно литературным данным, пики при 2930 и 2960 см-1 соответствуют симметричным и асимметричным колебаниям боковых радикалов -CH3 в мембранных липидах и белках, а пик при 2875 см-1 относится к растяжению связей CH2 [26,29]. Учитывая тот факт, что липиды являются основным компонентом внешней митохондриальной мембраны и мембраны теней эритроцитов, мы можем предположить, что наблюдаемые пики на спектрах ГКР митохондрий и теней эритроцитов принадлежат в основном липидам. Чтобы проверить происхождение пиков на спектрах ГКР митохондрий и мембран эритроцитов, мы регистрировали спектры ГКР от однослойных липосом, состоящих из ФХ, КЛ или протеолипосом ФХ:КЛ, содержащих молекулы цитохрома С внутри. Мы обнаружили, что липосомы, состоящие из чистого ФХ, дают наиболее интенсивный сигнал ГКР с высоким отношением сигнал / шум, тогда как липосомы, полученные из КЛ, дают гораздо менее интенсивные спектры ГКР с более низким отношением сигнал / шум. Для более наглядного сравнения каждый спектр ГКР липосом был нормирован на суммарную интенсивность. Спектр ГКР липосом из чистого ФХ содержит 3 основных пика: 2875, 2930 см-1 и самый интенсивный пик 2960 см-1. Спектр ГКР КЛ также имеет широкий пик при 2930 см-1 с небольшим плечом с положением 3010 см-1, относящимся к колебаниям ненасыщенных связей C = C, и менее интенсивный пик с положением 2860 см-1. Пик 2960 см-1 при этом отсутствует. Примечательно, что липосомы, содержащие как ФХ, так и КЛ с включенным цитохромом С, обладают спектром ГКР, почти идентичным спектру липосом из чистого ФХ. Данный факт можно объяснить следующим образом: (1) ФХ имеет более высокую интенсивность ГКР, чем КЛ, и, следовательно, ФХ «определяет» структуру спектра в смеси ФХ и КЛ; (2) КЛ в липосомной мембране не влияет на конформацию ФХ, и, следовательно, спектр ГКР ФХ не изменяется; (3) молекулы цитохрома С, заключенные в везикулы из ФХ:КЛ также не влияют на конформацию (и спектр ГКР) ФХ (по крайней мере, во время экспериментов ГКР). Важно отметить, что спектр ГКР митохондрий в рассматриваемом спектральном диапазоне подобен спектру ГКР липосом из ФХ. Единственное отличие состоит в том, что в спектрах ГКР митохондрий пики с положениями 2930 и 2960 см-1 имеют одинаковую интенсивность, тогда как в спектре ГКР липосом из ФХ пик 2960 см-1 является самым интенсивным. Спектр ГКР мембран эритроцитов также напоминает спектры ГКР липосом из ФХ. Однако он содержит небольшое плечо 2850 см-1, а пик 2930 см-1 обладает наибольшей интенсивностью. Мы полагаем, что наблюдаемые различия могут быть связаны с более сложным липидным составом мембран митохондрий и эритроцитов, чем липосом, что приводит к разнице в относительных интенсивностях их пиков ГКР. Полученные данные демонстрируют, что спектроскопия ГКР может быть успешно использована для изучения конформации липидов в биологических мембранах. Мы предполагаем, что подход, основанный на ГКР, может быть использован для получения информации о липидах плазматической мембраны различных клеток, помещенных на наноструктуры AgNSS после выделения или во время культивирования. Мониторинг конформации мембранных липидов может помочь определить повреждения мембран, перестройки и различные нарушения. По данным этого раздела опубликована статья «Probing lipids in biological membranes using SERS» в журнале «Mendeleev Communications». IV. Состояние цитохромов митохондрий в скелетных миоцитах пациентов, страдающих ожирением Чтобы исследовать цитохромы митохондрий в клетках с высокой автофлуоресценцей, какими являются скелетные миоциты, мы использовали метод нерезонасного КР в инфракрасной области (ИК КР), как описано нами ранее [9]. Мы сравнивали миоциты, полученные биопсией из скелетных мышц Vastus lateralis от двух пациентов одной возрастной группы (35-40 лет) с морбидным ожирением до развития диабета II типа мужского и женского пола. Клетки обоих пациентов содержали большое количество липидных капель. Спектры КР регистрировали с области вокруг 1 липидной капли. Для каждого пациента было исследовано не менее 3 миоцитов и зарегистрировано не менее 3 спектров с разных липидных капель. Пик 748 см-1 на спектре ИК КР характеризует колебания пиррольных колец в геме окисленного цитохрома С, пик 758 см-1 характеризует колебания пиррольных колец в геме окисленного цитохрома В и миоглобина. Пик 1004 см-1 характеризует колебания фенилаланина, по которому можно оценивать общее содержание белка. Пики 1210 и 1230 характерны для гемов типа В и С, соответственно, в обеих редокс-формах. Были рассчитаны соотношения интенсивностей пиков: I758/I1210 и I748/I1230, которые свидетельствуют о доли окисленных цитохромов В и С, соответственно, относительного общего содержания цитохромов. Соотношения I1210/I1004 и I1230/I1004 характеризуют количество цитохромов В и С, соответственно, относительно общего содержания белка. Было обнаружено, что в миоцитах, полученных от мужчины, количество цитохромов типа В в окисленной форме снижено. При этом, общее количество цитохромов типа В относительно содержания белка увеличено. Мы не обнаружили отличий в содержании и редокс-состояния цитохромов типа С. Снижение количества цитохромов типа В в окисленной форме означает относительное увеличение пула восстановленных цитохромов типа В. Как и в случае с прогениторными клетками при развитии воспаления (п. I.1), индуцированного TNFα, это может говорить о переполненности пула хинонов электронами вследствие их избыточного поступления от жирных кислот, что может, в свою очередь, провоцировать окислительный стресс. Однако обнаруженные половые отличия могут быть связаны с индивидуальными особенностями пациентов в большей степени, чем с половой принадлежностью, поэтому данные результаты стоит рассматривать как предварительные. Заключение Суммируя, в рамках проекта были разработаны методические подходы неинвазивного исследования редокс-состояния и распределения цитохромов В и С, а также определение содержания ненасыщенных жирных кислот в культуре клеток на основе спектроскопии КР, не требующей специальной подготовки проб, фиксации или окрашивания. Были выявлены изменения в состоянии митохондрий клеток при индукции воспаления различными факторами: провоспалительными цитокинами и оксидантами, предложена модель, описывающая наблюдаемые изменения. Были обнаружены отличия в редокс-состоянии цитохромов митохондрий скелетных мышц мужчины и женщины, страдающих ожирением. Также был разработан методический подход получения липосом, содержащих кардиолипин, с цитохромом С внутри, и впервые получены спектры ГКР от таких липосом для одновременного изучения гемов и липидов. Были изучены конформационные изменения гема окисленного цитохрома С в изолированных митохондриях и липосомах при наличии ионных токов через мембрану. По результатам проекта опубликованы 2 научные статьи и 2 тезиса в международных рецензируемых научных изданиях, а также 5 тезисов в сборниках. Список литературы: 1. Kakita M., Kaliaperumal V., Hamaguchi H. Resonance Raman quantification of the redox state of cytochromes b and c in-vivo and in-vitro. // J. Biophotonics. 2012. Vol. 5, № 1. P. 20–24. 2. Brazhe N.A. et al. Mapping of redox state of mitochondrial cytochromes in live cardiomyocytes using Raman microspectroscopy. // PLoS One. 2012. Vol. 7, № 9. P. e41990. 3. Berezhna S., Wohlrab H., Champion P.M. Resonance Raman investigations of cytochrome c conformational change upon interaction with the membranes of intact and Ca2+-exposed mitochondria. // Biochemistry. 2003. Vol. 42, № 20. P. 6149–6158. 4. Wu H. et al. In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy // Proc. Natl. Acad. Sci. 2011. Vol. 108, № 9. P. 3809–3814. 5. Issop L. et al. Translocator Protein-Mediated Stabilization of Mitochondrial Architecture during Inflammation Stress in Colonic Cells // PLoS One / ed. Chandra D. 2016. Vol. 11, № 4. P. e0152919. 6. Roca F.J., Ramakrishnan L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species // Cell. Elsevier Inc., 2013. Vol. 153, № 3. P. 521–534. 7. Yang D. et al. Pro-inflammatory cytokines increase reactive oxygen species through mitochondria and NADPH oxidase in cultured RPE cells // Exp. Eye Res. 2007. Vol. 85, № 4. P. 462–472. 8. Hahn W.S. et al. Proinflammatory cytokines differentially regulate adipocyte mitochondrial metabolism, oxidative stress, and dynamics // Am. J. Physiol. Metab. 2014. Vol. 306, № 9. P. E1033–E1045. 9. Brazhe N.A. et al. Raman probing of lipids, proteins, and mitochondria in skeletal myocytes: a case study on obesity // J. Raman Spectrosc. 2017. Vol. 48, № 9. 10. Gnaiger E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. Innsbruck, Austria: OROBOROS INSTRUMENTS Corp, 2014. 81 p. 11. Bell C. et al. Quantitative Proteomics Reveals the Induction of Mitophagy in Tumor Necrosis Factor-α-activated (TNFα) Macrophages // Mol. Cell. Proteomics. 2013. Vol. 12, № 9. P. 2394–2407. 12. Pan G.J. et al. A pivotal role for NF-κB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid // Arch. Biochem. Biophys. Elsevier Inc., 2018. Vol. 642. P. 23–30. 13. Love D.T. et al. Cellular targets of the myeloperoxidase-derived oxidant hypothiocyanous acid (HOSCN) and its role in the inhibition of glycolysis in macrophages // Free Radic. Biol. Med. 2016. Vol. 94. P. 88–98. 14. Brazhe A.R. Pyraman. 15. Brazhe N.A. et al. Monitoring of blood oxygenation in brain by resonance Raman spectroscopy // J. Biophotonics. 2018. Vol. 11, № 6. 16. Semenova A. a. et al. Planar SERS nanostructures with stochastic silver ring morphology for biosensor chips // J. Mater. Chem. 2012. Vol. 22, № 47. P. 24530. 17. Brazhe N.A. et al. Probing cytochrome c in living mitochondria with surface-enhanced Raman spectroscopy // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 5, № 1. P. 13793. 18. Grivennikova V.G., Kozlovsky V.S., Vinogradov A.D. Respiratory complex II: ROS production and the kinetics of ubiquinone reduction // Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg. 2017. Vol. 1858, № 2. P. 109–117. 19. Ray K. et al. Distance dependence of surface plasmon-coupled emission observed using Langmuir-Blodgett films. // Applied physics letters. 2007. Vol. 90, № 25. P. 251116. 20. Wokaun a. et al. Energy transfer in surface enhanced luminescence // The Journal of Chemical Physics. 1983. Vol. 79, № 1. P. 509. 21. Moskovits M. Surface roughness and the enhanced intensity of Raman scattering by molecules adsorbed on metals // J. Chem. Phys. 1978. Vol. 69, № 9. P. 4159. 22. Еремина О.Е. et al. Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния в современном химическом анализе: достижения и перспективы использования // Успехи химии. 2018. Vol. 87, № 8. P. 741–770. 23. Morota S., Piel S., Hansson M.J. Respiratory uncoupling by increased H(+) or K(+) flux is beneficial for heart mitochondrial turnover of reactive oxygen species but not for permeability transition. // BMC Cell Biol. BMC Cell Biology, 2013. Vol. 14, № 1. P. 40. 24. Chertkova R. V. et al. New insight into the mechanism of mitochondrial cytochrome c function // PLoS One. 2017. Vol. 12, № 5. P. e0178280. 25. Burgess S. Liposome Preparation - Avanti® Polar Lipids [Electronic resource]. 1998. URL: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/liposome-preparation.html. 26. Saint-Pierre Chazalet M. et al. Surface-enhanced Raman scattering studies of lipid planar bilayers in water // Thin Solid Films. 1994. Vol. 244, № 1–2. P. 852–856. 27. Taylor R.W. et al. Watching individual molecules flex within lipid membranes using SERS // Sci. Rep. 2014. Vol. 4. P. 1–6. 28. Brazhe N.A. et al. New insight into erythrocyte through in vivo surface-enhanced Raman spectroscopy // Biophys. J. 2009. Vol. 97, № 12. P. 3206–3214. 29. Borchman D., Tang D., Yappert M.C. Lipid composition, membrane structure relationships in lens and muscle sarcoplasmic reticulum membranes // Biospectroscopy. 1999. Vol. 5, № 3. P. 151–167.