ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Для успешной реализации задач современной реконструктивной медицины необходимо создание и разработка искусственного межклеточного матрикса, обеспечивающего оптимальное взаимодействие тканевого микроокружения и клеток кератиноцитов и фибробластов. Понимание механизмов регенерации тканей — основа успеха при выполнении таких задач. В ходе реализации предлагаемого проекта на основе скэффолдов из регенерированного фиброина будет создан искусственный межклеточный матрикс (ИММ), имитирующий структуру децеллюляризованной кожи. При разработке дизайна ИММ будут отобраны варианты скэффолдов, обеспечивающих оптимальную адгезию и пролиферацию основных типов клеток кожи — кератиноцитов и фибробластов, а также мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга. Будут исследованы особенности роста этих клеток на внешней и внутренней поверхностях ИММ. В том числе будут проведены эксперименты по длительному культивированию клеток на ИММ в различных сочетаниях с целью формирования искусственной кожи in vitro. Биодеградация ИММ будет изучена в модельных системах in vivo и in vitro. Регенеративный потенциал скэффолдов и созданного на их основе ИММ будет оценен в модели полнослойной раны кожи у мышей, представляющий наиболее тяжелый тип повреждений кожного покрова. Для усиления регенеративного потенциала скэффолды и ИММ будут витализированы различными клеточными композициями, состоящими из кератиноцитов, фибробластов, субпопуляций макрофагов и ММСК. В ходе экспериментов in vivo будет установлено оптимальное соотношение компонентов ИММ, уменьшающих фиброз и ускоряющих регенерацию. В результате проекта будут получены принципиально новые данные о клеточных и молекулярных механизмах регенерации, имеющие значение для фундаментальных исследований. Научно-прикладная составляющая проекта будет представлена созданием новых искусственных аналогов межклеточного матрикса, а также методов регенерации кожи.
К концу первого года выполнения проекта будет отработана и оптимизирована мышиная модель полнослойных ран кожи. Будет установлена динамика регенеративного процесса на основе данных по внешнему состоянию повреждений. Для дальнейшего использования в качестве основы для ИММ будут получены и охарактеризованы биоинженерные микрочастицы. Будет изучено влияние их введения на процесс заживления. Будет получена уникальная первичная культура мышиных кератиноцитов, экспрессирующих GFP. Для проверки направления дифференцировки полученных клеток в них будет изучена экспрессия генов, характерных для кератиноцитов, а также экспрессия поверхностных маркеров методами проточной цитометрии и микроскопии. Также будет отработана методика анализа экспрессии в месте кожного повреждения генов, ответственных за различные этапы регенеративного процесса. Для этого будут функционально оценены специфичные праймеры к мРНК этих генов, и будет изучена динамика их экспрессии в условиях заживления раны как без дополнительного вмешательства, так и при добавлении биоинженерных микрочастиц. Эти данные послужат основой для дальнейшей оценки эффективности использования витализированных или бесклеточных ИММ для кожной регенерации. Кроме того, в течение первого года будут отработаны протоколы получения ММСК из культуры костного мозга, а также будет определена экспрессия маркеров, специфичных для стволовых клеток. В случае успеха, ММСК будут использованы для витализации ИММ отдельно или вместе с дифференцированными кератиноцитами и другими клетками. Полученные системы будут перспективным инструментом для ускорения и повышения эффективности заживления кожных ран.
Коллектив исполнителей, представленный сотрудниками кафедры биоинженерии и лаборатории конфокальной микроскопии, имеет многолетний опыт исследований в области регенеративной медицины и тканевой инженерии. Опубликованные научные труды содержат сведения о клеточных механизмах регенерации тканей при использовании трехмерных конструкций из биорезорбируемых материалов и компонентов межклеточного матрикса. В ходе предшествующей работы были модифицированы описанные в литературе подходы и разработаны собственные методы получения скэффолдов. Были разработаны оригинальные подходы к модификации и функционализации скэффолдов. Весь накопленный опыт разработки трехмерных конструкций будет использован творческим коллективом для создания искусственного межклеточного матрикса (ИММ), имитирующего строение децелюляризированной кожи. Кроме того, у авторов заявки есть многолетний опыт работы с экспериментальными моделями различных заболеваний у мышей, а также в применении биоматериалов in vivo для регенерации костной ткани. На протяжении многих лет в лаборатории молекулярных механизмов иммунитета ИМБ РАН проводятся физиологические исследования на генетически-модифицированных линиях мышей, имеющих дефекты в цитокиновых сигнальных каскадах, в том числе вовлеченных в регуляцию иммунной защиты в барьерных тканях. Разработанные протоколы с учетом специфики кожной ткани могут быть адаптированы для получения культур, которые затем будут использованы для формирования или заселения искусственных межклеточных матриксов. Модель полнослой раны кожи мыши была использована ранее для оценки влияния невитализированных микрочастиц из спидроина на скорость заживления раны и эффективность регенерации функциональных слоев кожи.
В ходе выполнения проекта созданы новые искусственные межклеточные матриксы (ИММ). Основой этих ИММ является биорезорбируемый трехмерный пористый фиброин-желатиновый матрикс. Отличительной особенностью такого матрикса является перфорированные стенки пор, с характерным микрорельефом. Микрорельеф и многочисленные отверстия в стенках пор улучшают условия для роста и дифференцировки клеточных популяций, увеличивая площадь для адгезии клеток, пространство для жидкой фазы, содержащей питательные вещества, улучшают газообмен и процессы выведения продуктов метаболизма. Матриксы с перфорированными стенками пор могут быть сформированы на фиброинсодержащих пленках, полученных методом полива или фотоотверждения. Для разработки этих ИММ, в частности при выборе композитного состава материала матриксов, использовались данные, полученные в ходе выполнения задач проекта в 2015, 2016 и 2017 г. Исследована регенеративная и провоспалительная активность авитализированных ИММ и их фрагментов. Также были проведены исследования по влиянию витализации ИММ и их производных на заживление полнослойной раны кожи. Для витализации использовали мышиные эмбриональные фибробласты, кератиноциты, экспрессирующие цитокератины 5 и 14, макрофаги, а также клеточные композиции, составленные из этих клеток. Эффективность регенерации оценивали по морфометрическим данным состояния раны, гистологическим и иммунохимическим показателями. Было выявлено наличие регенеративной активности у ИММ и их производных, как при использовании в ацеллюлярной форме, так и при витализации. Как и ожидалось, витализация усиливает регенеративную активность. Изолированные кератиноциты и кератиноциты, сокультивируемые с мышиными эмбриональными фибробластами, оказывали максимальный положительный эффект на регенеративную активность ИММ. Также на заключительном этапе проекта была продолжена работа по исследованию влияния клеточных и молекулярных компонентов воспалительного процесса на регенерацию кожи. Основное внимание было уделено исследованию влияния ИММ и их компонентов на привлечение иммунокомпетентных клеток в область регенерации, а также на экспрессию клетками генов провоспалительных цитокинов Tnf, Il6, Il1b, Ccl2. У новорожденных мышей MN-IL-6 Tg с оверэкспрессией IL-6 в миелоидных клетках, используемых на данном этапе для изучения вклада провоспалительных цитокинов в кожный гомеостаз, при гистологическом анализе было обнаружено существенное подавление роста волосяных фолликулов, а также инфильтрация кожи иммунными клетками. Выяснилось, что такие животные погибают во время эмбрионального развития и в первые дни после рождения. Из результатов этой и предшествующей работы следует, что модуляция ИММ воспалительной реакции способствует ускорению регенерации кожи, однако избыточное воспаление существенно нарушает кожный гомеостаз, что необходимо учитывать при создании биоискусственных аналогов кожи, содержащих материалы, способные модулировать воспалительный ответ. В результате выполнения проекта был создан искусственный межклеточный матрикс с перфорированными стенками пор, с характерным микрорельефом, и представляющий собой аналог децеллюляризированного кожного лоскута. Большинство важнейших результатов проекта получены на стыке таких дисциплин как клеточная биология, иммунология, биоинженерия, биомедицина и регенеративная медицина. Результаты выполненных исследований и сопоставление результатов, полученных в ходе выполнения Проекта, с мировым уровнем позволяют утверждать, что полученные нами данные соответствуют тенденциям и уровню выполняемых в мире аналогичных исследований в этой области и имеют перспективы для дальнейшего развития, в том числе и с целью практического использования в клинической практике для реконструкции и регенерации кожи.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 5 августа 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Искусственный межклеточный матрикс для реконструкции кожи |
Результаты этапа: На первом году выполнения проекта были решены следующие задачи: 1.Для изучения эффективности регенерации при использовании искусственного межклеточного матрикса (ИММ) была отработана и оптимизирована модель мышиной полнослойной раны кожи. 2.Для изучения влияния модификаций ИММ на регенерацию кожи была разработана методика получения фрагментов ИММ путем криоизмельчения пористых фиброиновых скаффолдов. Отработана методика получения фракций фрагментов скаффолдов разного состава заданных размеров в диапазоне от 100 до 250 мкм. Проведен микроскопический анализ поверхностей фрагментов ИММ. Поверхность фрагментов ИММ имела сложную форму, обеспечивающую большую площадь для адгезии клеток. На поверхности фрагментов выявлялись структуры рельефа микронного и субмикронного размера, необходимые для эффективной адгезии клеток. 3.На модели полнослойной раны кожи было исследовано влияние инъекции фрагментов ИММ в непосредственной близости от повреждения. Анализ внешнего состояния раны показал, что применение фрагментов ИММ замедляет контракцию раны в первые дни заживления и ускоряет процесс заживления. Гистологический анализ обнаружил, что в экспериментальной группе животных наблюдалось восстановление всех структурных элементов кожи: эпидермиса и дермы, включая придатки кожи (волосяные фолликулы и сальные железы), нервы и кровеносные сосуды. В контрольной группе в области зажившей раны выявлялись эпителий, плотная соединительная ткань с волокнами зрелого коллагена и рыхлая соединительная ткань, но отсутствовали придатки кожи, нервы и сосуды. Таким образом, мы обнаружили, что инъекция невитализированных фрагментов ИММ стимулирует регенерацию кожи. 4.Исследована зависимость динамики регенеративных процессов кожи от фактора некроза опухоли (TNF), производимого макрофагами, по оценке площади очага роста волосяных фолликул. Было показано, что рост волосяных фолликул, индуцированный полнослойным повреждением кожи, у мышей с инактивацией TNF только в макрофагах значительно снижен по сравнению с мышами дикого типа, что указывает на важную роль TNF как медиатора воспаления в регенеративных процессах в коже. 5.Проведен анализ влияния фрагментов ИММ на экспрессию генов провоспалительных цитокинов tnf, il6, cxcl1, cxcl2, il1b в образцах кожи при заживлении полнослойных ран. Экспрессия генов провоспалительных цитокинов, таких как tnf, cxcl1, il6, cxcl2, il1b, была значительно выше в образцах кожи на первый день после нанесения ран и постепенно снижалась в процессе заживления ткани как при инъекции фрагментов ИММ, так и в контрольной группе. Экспрессия генов противовоспалительных цитокинов – tgfb и il10 была также одинакова в контрольной и экспериментальной группе. Однако было показано, что инъекция фрагментов ИММ приводит к увеличению экспрессии гена fgf7, продукт которого является одним из основных факторов роста кератиноцитов, по сравнению с контрольной группой. 6.Для оценки способности искусственного межклеточного матрикса поддерживать клеточную адгезию и пролиферацию был отработан уникальный метод выделения и идентификации первичной культуры базальных кератиноцитов. Для подтверждения базальной природы кератиноцитов были использованы методы проточной цитофлуориметрии, конфокальной микроскопии и метод ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов, специфических для кератиноцитов, и наличие маркеров базальных кератиноцитов цитокератинов 5 и 14 подтвердили природу полученной культуры. | ||
2 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Искусственный межклеточный матрикс для реконструкции кожи |
Результаты этапа: Получена серия гибридных скаффолдов, имитирующих внеклеточный матрикс. ИММ были модифицированы различными композиционными добавками. Для модификации использовали такие перспективные композиционные добавки, как компоненты внеклеточного матрикса, а именно фибронектин и производные коллагена. Методом электронной микроскопии было изучено влияние модификаций ИММ на его микрорельеф. Методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии изучено влияние модификаций ИММ на адгезию, пролиферацию и жизнеспособность клеток различного происхождения, в том числе иммортализованных фибробластов и кератиноцитов. Получены данные о скорости деградации ИММ в модельной системе in vitro в нейтральных условиях и в окисляющей среде в модельной системе с использованием реактива Фентона. Проведен анализ механических свойств образцов ИММ с использованием механических испытаний на разрыв, в том числе измерение модуля Юнга, предельного удлинения и предела текучести. Изучена динамика экспрессии провоспалительных и противовспалительных цитокинов, а также хемокинов и ростовых факторов в процессе заживления для выявления вклада воспаления репарацию ткани при полнослойном повреждении кожи.Проведен сравнительный анализ процессов регенерации с использованием ИММ разного состава. С использованием методов световой микроскопии выявлены клетки иммунной системы, вовлеченные в регенерацию кожи. Для дальнейших экспериментов по витализации матриксов проведено раздельное и совместное культивирование кератиноцитов и фибробластов - важнейших для регенерации кожи клеток, введение которых в состав искусственного межклеточного матрикса должно способствовать более быстрому и оптимальному заживлению кожной раны, а также лучшему пониманию роли этих типов клеток в процессе регенерации. В модели полнослойной раны кожи исследован регенеративный потенциал ИММ, а также получены данные по клеточным механизмам регенерации. | ||
3 | 26 октября 2017 г.-8 октября 2018 г. | Искусственный межклеточный матрикс для реконструкции кожи |
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта созданы новые искусственные межклеточные матриксы (ИММ). Основой этих ИММ является биорезорбируемый трехмерный пористый фиброин-желатиновый матрикс. Отличительной особенностью такого матрикса является перфорированные стенки пор, с характерным микрорельефом. Микрорельеф и многочисленные отверстия в стенках пор улучшают условия для роста и дифференцировки клеточных популяций, увеличивая площадь для адгезии клеток, пространство для жидкой фазы, содержащей питательные вещества, улучшают газообмен и процессы выведения продуктов метаболизма. Матриксы с перфорированными стенками пор могут быть сформированы на фиброинсодержащих пленках, полученных методом полива или фотоотверждения. Для разработки этих ИММ, в частности при выборе композитного состава материала матриксов, использовались данные, полученные в ходе выполнения задач проекта в 2015, 2016 и 2017 г. Исследована регенеративная и провоспалительная активность авитализированных ИММ и их фрагментов. Также были проведены исследования по влиянию витализации ИММ и их производных на заживление полнослойной раны кожи. Для витализации использовали мышиные эмбриональные фибробласты, кератиноциты, экспрессирующие цитокератины 5 и 14, макрофаги, а также клеточные композиции, составленные из этих клеток. Эффективность регенерации оценивали по морфометрическим данным состояния раны, гистологическим и иммунохимическим показателями. Было выявлено наличие регенеративной активности у ИММ и их производных, как при использовании в ацеллюлярной форме, так и при витализации. Как и ожидалось, витализация усиливает регенеративную активность. Изолированные кератиноциты и кератиноциты, сокультивируемые с мышиными эмбриональными фибробластами, оказывали максимальный положительный эффект на регенеративную активность ИММ. Также на заключительном этапе проекта была продолжена работа по исследованию влияния клеточных и молекулярных компонентов воспалительного процесса на регенерацию кожи. Основное внимание было уделено исследованию влияния ИММ и их компонентов на привлечение иммунокомпетентных клеток в область регенерации, а также на экспрессию клетками генов провоспалительных цитокинов Tnf, Il6, Il1b, Ccl2. У новорожденных мышей MN-IL-6 Tg с оверэкспрессией IL-6 в миелоидных клетках, используемых на данном этапе для изучения вклада провоспалительных цитокинов в кожный гомеостаз, при гистологическом анализе было обнаружено существенное подавление роста волосяных фолликулов, а также инфильтрация кожи иммунными клетками. Выяснилось, что такие животные погибают во время эмбрионального развития и в первые дни после рождения. Из результатов этой и предшествующей работы следует, что модуляция ИММ воспалительной реакции способствует ускорению регенерации кожи, однако избыточное воспаление существенно нарушает кожный гомеостаз, что необходимо учитывать при создании биоискусственных аналогов кожи, содержащих материалы, способные модулировать воспалительный ответ. В результате выполнения проекта был создан искусственный межклеточный матрикс с перфорированными стенками пор, с характерным микрорельефом, и представляющий собой аналог децеллюляризированного кожного лоскута. Большинство важнейших результатов проекта получены на стыке таких дисциплин как клеточная биология, иммунология, биоинженерия, биомедицина и регенеративная медицина. Результаты выполненных исследований и сопоставление результатов, полученных в ходе выполнения Проекта, с мировым уровнем позволяют утверждать, что полученные нами данные соответствуют тенденциям и уровню выполняемых в мире аналогичных исследований в этой области и имеют перспективы для дальнейшего развития, в том числе и с целью практического использования в клинической практике для реконструкции и регенерации кожи. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".