Искусственный межклеточный матрикс для реконструкции кожиНИР

Artificial Intercellular Matrix for Skin Reconstruction

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 5 августа 2015 г.-31 декабря 2015 г. Искусственный межклеточный матрикс для реконструкции кожи
Результаты этапа: На первом году выполнения проекта были решены следующие задачи: 1.Для изучения эффективности регенерации при использовании искусственного межклеточного матрикса (ИММ) была отработана и оптимизирована модель мышиной полнослойной раны кожи. 2.Для изучения влияния модификаций ИММ на регенерацию кожи была разработана методика получения фрагментов ИММ путем криоизмельчения пористых фиброиновых скаффолдов. Отработана методика получения фракций фрагментов скаффолдов разного состава заданных размеров в диапазоне от 100 до 250 мкм. Проведен микроскопический анализ поверхностей фрагментов ИММ. Поверхность фрагментов ИММ имела сложную форму, обеспечивающую большую площадь для адгезии клеток. На поверхности фрагментов выявлялись структуры рельефа микронного и субмикронного размера, необходимые для эффективной адгезии клеток. 3.На модели полнослойной раны кожи было исследовано влияние инъекции фрагментов ИММ в непосредственной близости от повреждения. Анализ внешнего состояния раны показал, что применение фрагментов ИММ замедляет контракцию раны в первые дни заживления и ускоряет процесс заживления. Гистологический анализ обнаружил, что в экспериментальной группе животных наблюдалось восстановление всех структурных элементов кожи: эпидермиса и дермы, включая придатки кожи (волосяные фолликулы и сальные железы), нервы и кровеносные сосуды. В контрольной группе в области зажившей раны выявлялись эпителий, плотная соединительная ткань с волокнами зрелого коллагена и рыхлая соединительная ткань, но отсутствовали придатки кожи, нервы и сосуды. Таким образом, мы обнаружили, что инъекция невитализированных фрагментов ИММ стимулирует регенерацию кожи. 4.Исследована зависимость динамики регенеративных процессов кожи от фактора некроза опухоли (TNF), производимого макрофагами, по оценке площади очага роста волосяных фолликул. Было показано, что рост волосяных фолликул, индуцированный полнослойным повреждением кожи, у мышей с инактивацией TNF только в макрофагах значительно снижен по сравнению с мышами дикого типа, что указывает на важную роль TNF как медиатора воспаления в регенеративных процессах в коже. 5.Проведен анализ влияния фрагментов ИММ на экспрессию генов провоспалительных цитокинов tnf, il6, cxcl1, cxcl2, il1b в образцах кожи при заживлении полнослойных ран. Экспрессия генов провоспалительных цитокинов, таких как tnf, cxcl1, il6, cxcl2, il1b, была значительно выше в образцах кожи на первый день после нанесения ран и постепенно снижалась в процессе заживления ткани как при инъекции фрагментов ИММ, так и в контрольной группе. Экспрессия генов противовоспалительных цитокинов – tgfb и il10 была также одинакова в контрольной и экспериментальной группе. Однако было показано, что инъекция фрагментов ИММ приводит к увеличению экспрессии гена fgf7, продукт которого является одним из основных факторов роста кератиноцитов, по сравнению с контрольной группой. 6.Для оценки способности искусственного межклеточного матрикса поддерживать клеточную адгезию и пролиферацию был отработан уникальный метод выделения и идентификации первичной культуры базальных кератиноцитов. Для подтверждения базальной природы кератиноцитов были использованы методы проточной цитофлуориметрии, конфокальной микроскопии и метод ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов, специфических для кератиноцитов, и наличие маркеров базальных кератиноцитов цитокератинов 5 и 14 подтвердили природу полученной культуры.
2 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Искусственный межклеточный матрикс для реконструкции кожи
Результаты этапа: Получена серия гибридных скаффолдов, имитирующих внеклеточный матрикс. ИММ были модифицированы различными композиционными добавками. Для модификации использовали такие перспективные композиционные добавки, как компоненты внеклеточного матрикса, а именно фибронектин и производные коллагена. Методом электронной микроскопии было изучено влияние модификаций ИММ на его микрорельеф. Методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии изучено влияние модификаций ИММ на адгезию, пролиферацию и жизнеспособность клеток различного происхождения, в том числе иммортализованных фибробластов и кератиноцитов. Получены данные о скорости деградации ИММ в модельной системе in vitro в нейтральных условиях и в окисляющей среде в модельной системе с использованием реактива Фентона. Проведен анализ механических свойств образцов ИММ с использованием механических испытаний на разрыв, в том числе измерение модуля Юнга, предельного удлинения и предела текучести. Изучена динамика экспрессии провоспалительных и противовспалительных цитокинов, а также хемокинов и ростовых факторов в процессе заживления для выявления вклада воспаления репарацию ткани при полнослойном повреждении кожи.Проведен сравнительный анализ процессов регенерации с использованием ИММ разного состава. С использованием методов световой микроскопии выявлены клетки иммунной системы, вовлеченные в регенерацию кожи. Для дальнейших экспериментов по витализации матриксов проведено раздельное и совместное культивирование кератиноцитов и фибробластов - важнейших для регенерации кожи клеток, введение которых в состав искусственного межклеточного матрикса должно способствовать более быстрому и оптимальному заживлению кожной раны, а также лучшему пониманию роли этих типов клеток в процессе регенерации. В модели полнослойной раны кожи исследован регенеративный потенциал ИММ, а также получены данные по клеточным механизмам регенерации.
3 26 октября 2017 г.-8 октября 2018 г. Искусственный межклеточный матрикс для реконструкции кожи
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта созданы новые искусственные межклеточные матриксы (ИММ). Основой этих ИММ является биорезорбируемый трехмерный пористый фиброин-желатиновый матрикс. Отличительной особенностью такого матрикса является перфорированные стенки пор, с характерным микрорельефом. Микрорельеф и многочисленные отверстия в стенках пор улучшают условия для роста и дифференцировки клеточных популяций, увеличивая площадь для адгезии клеток, пространство для жидкой фазы, содержащей питательные вещества, улучшают газообмен и процессы выведения продуктов метаболизма. Матриксы с перфорированными стенками пор могут быть сформированы на фиброинсодержащих пленках, полученных методом полива или фотоотверждения. Для разработки этих ИММ, в частности при выборе композитного состава материала матриксов, использовались данные, полученные в ходе выполнения задач проекта в 2015, 2016 и 2017 г. Исследована регенеративная и провоспалительная активность авитализированных ИММ и их фрагментов. Также были проведены исследования по влиянию витализации ИММ и их производных на заживление полнослойной раны кожи. Для витализации использовали мышиные эмбриональные фибробласты, кератиноциты, экспрессирующие цитокератины 5 и 14, макрофаги, а также клеточные композиции, составленные из этих клеток. Эффективность регенерации оценивали по морфометрическим данным состояния раны, гистологическим и иммунохимическим показателями. Было выявлено наличие регенеративной активности у ИММ и их производных, как при использовании в ацеллюлярной форме, так и при витализации. Как и ожидалось, витализация усиливает регенеративную активность. Изолированные кератиноциты и кератиноциты, сокультивируемые с мышиными эмбриональными фибробластами, оказывали максимальный положительный эффект на регенеративную активность ИММ. Также на заключительном этапе проекта была продолжена работа по исследованию влияния клеточных и молекулярных компонентов воспалительного процесса на регенерацию кожи. Основное внимание было уделено исследованию влияния ИММ и их компонентов на привлечение иммунокомпетентных клеток в область регенерации, а также на экспрессию клетками генов провоспалительных цитокинов Tnf, Il6, Il1b, Ccl2. У новорожденных мышей MN-IL-6 Tg с оверэкспрессией IL-6 в миелоидных клетках, используемых на данном этапе для изучения вклада провоспалительных цитокинов в кожный гомеостаз, при гистологическом анализе было обнаружено существенное подавление роста волосяных фолликулов, а также инфильтрация кожи иммунными клетками. Выяснилось, что такие животные погибают во время эмбрионального развития и в первые дни после рождения. Из результатов этой и предшествующей работы следует, что модуляция ИММ воспалительной реакции способствует ускорению регенерации кожи, однако избыточное воспаление существенно нарушает кожный гомеостаз, что необходимо учитывать при создании биоискусственных аналогов кожи, содержащих материалы, способные модулировать воспалительный ответ. В результате выполнения проекта был создан искусственный межклеточный матрикс с перфорированными стенками пор, с характерным микрорельефом, и представляющий собой аналог децеллюляризированного кожного лоскута. Большинство важнейших результатов проекта получены на стыке таких дисциплин как клеточная биология, иммунология, биоинженерия, биомедицина и регенеративная медицина. Результаты выполненных исследований и сопоставление результатов, полученных в ходе выполнения Проекта, с мировым уровнем позволяют утверждать, что полученные нами данные соответствуют тенденциям и уровню выполняемых в мире аналогичных исследований в этой области и имеют перспективы для дальнейшего развития, в том числе и с целью практического использования в клинической практике для реконструкции и регенерации кожи.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".