ИСТИНА

Целевая доставка биологически активных соединений является одной из ключевых задач современной медицины. Использование липосом- везикул, самопроизвольно образующихся амфифильными липидами в водно-солевых средах, позволило существенно повысить растворимость, биодоступность, а также время циркулирования в кровотоке ряда лекарственных средств. Уникальность строения липосом позволяет инкапсулировать как жирорастворимые молекулы в области липидных хвостов, так и гидрофильные молекулы во внутренней полости везикул. В то же время существуют принципиальные недостатки липосомальных препаратов, которые ограничивают их применение в качестве систем для доставки лекарств: 1) в большинстве случаев лекарство высвобождается в кровотоке, а не в той ткани, где оно необходимо; 2) даже если липосомы адресно доставлены в место предполагаемого действия, действующее вещество может не достигнуть своей цели, так как отсутствует механизм его высвобождения; 3) количество терапевтического агента, доставляемого одним наноконтейнером в клетку может оказаться недостаточным для проявления нужного эффекта; что особенно характерно для случая липофильных лекарств, загружаемых в липидный бислой. В данном проекте планируется разработать систему для доставки биологически активных веществ на основе комплекса микрогель-липосомы, в которой будут преодолены все вышеперечисленные недостатки. Кроме того, предлагаемая система содержит дополнительный ряд преимуществ: 1) возможность совместной доставки нескольких терапевтических агентов в заранее заданных соотношениях; 2) существенное увеличение количества липофильного действующего вещества, приходящееся на один контейнер.

Targeted delivery of biologically active compounds is one of the key concepts of the modern medicine. The use of liposomes – vesicles which are spontaneously formed in water-salt media by amphiphilic lipids, allowed to increase solubility, bioavailability and circulation life-time of many therapeutic agents. The structure of liposomes provides the possibility to encapsulate lipophilic molecules within the lipid bilayer and hydrophilic ones in the aqueous core of vesicles. At the same time there are still several disadvantages of liposomal formulations that limit their biomedical applications: 1) in most cases, the encapsulated compound is released spontaneously in the bloodstream and does not reach its target site; 2) even when liposomes are delivered to their destination, the drug is not released and, thus, not consumed by the cells; 3) the amount of a therapeutic agent that is delivered in a cell by one carrier may be insufficient to cause the desired effect; this is especially the case when lipophilic drugs are loaded in liposomes. This project aims to develop the system for delivery of biologically active agents based on microgel-liposome complexes which will overcome to a great extent all the above-described problems of conventional liposomes. Moreover, this system is expected to provide some additional advantages such as 1) possibility of codelivery of several compounds in predetermined ratios; 2) significant increase in the amount of a lipophilic drug in one carrier.

В результате исследования будут получены следующие результаты: 1) оценено количество максимального количества липосом, которое можно адсорбировать на одной частице микрогеля и произведено сравнение с теоретическими расчётами. Это позволит установить происходит адсорбция с полным или же лишь с частичным заполнением поверхности микрогеля. Этот результат важен для предсказания соотношения лекарство/носитель (по массе, например) для подобных мультилипосомальных систем. В исследованиях похожих систем таких оценок не сделано [MacKinnon N, Guérin G, Liu B, Gradinaru CC, Rubinstein JL, Macdonald PM. Triggered instability of liposomes bound to hydrophobically modified core-shell PNIPAM hydrogel beads. Langmuir 2010;26(2):1081-1089.], [Yaroslavov AA, Panova DI, Sybachin DA, Spiridonov DV, Zezin PA, Mergel O, et al. Payload release by liposome burst: Thermal collapse of microgels induces satellite destruction. Nanomed Nanotechnol Biol Med 2017;13(4):1491-1494.]. 2) оценена кинетика высвобождения содержимого. Скорость высвобождения является принципиальным вопросом для доставки и поэтому важно подобрать условия в системе микрогель-липосомы для максимально быстрого высвобождения инкапсулированного вещества. 3) будет установлен механизм высвобождения инкапсулированного содержимого из липосом, адсорбированных на микрогеле при его коллапсе, индуцированном повышением температуры. В схожих работах (цитировались в пункте 1 данного раздела) механизм постулируется, но экспериментальные подтверждения не приводятся. 4) будут получены ранее нигде не описанные биодеградируемые комплексы микрогель-липосомы. Получение такой системы станет заделом для последующих исследований цитотоксичности, взаимодействий с биологическими средами, клетками и исследований на животных.

К данному моменту синтезированы термочувствительные микрогели на основе на основе N-изопропилакриламида (НИПАМ), придающего термочувствительность, диметиламинопропилметакриламида (ДМАПМА), обеспечивающего возможность придания положительного заряда, и бисакриламида (БИС), сшивающего полимеризующиеся макромолекулы в трёхмерную сетку микрогеля. Была исследована коллоидная стабильность растворов микрогелей в водно-солевых средах. Изучены термочувствительные свойства: изменение размера при повышении температуры, влияние на этот процесс pH и ионной силы раствора. Исследована агрегация в системе микрогель-липосомы при низких значениях ионной силы (порядка 0.01М) в буферных растворах на основе трис(гидроксиметил)аминометана и фосфата в зависимости от концентрации добавленных яФХ:ФС (7:3 и 7:1) липосом. Показана возможность адсорбции липосом на микрогелях без нарушения целостности липидной мембраны, что является необходимым условием для формирования системы для доставки. Продемонстрирована принципиальная возможность создания термочувствительной системы на основе комплексов микрогель-липосомы: показано, что повышение температуры приводит к высвобожению загруженного в липосомы вещества (продемонстрировано на примере доксорубицина [Yaroslavov AA, Panova DI, Sybachin DA, Spiridonov DV, Zezin PA, Mergel O, et al. Payload release by liposome burst: Thermal collapse of microgels induces satellite destruction. Nanomed Nanotechnol Biol Med 2017;13(4):1491-1494.]. и карбоксифлуоресцеина [Ivashkov O.V., Kostenko S.N., Sybachin A.V., Yaroslavov A.A. How does microgel collapse induce leakage of contents from adsorbed liposomes? VI Всероссийская с Международным участием школа-конференция для молодых учёных «Макромолекулярные нанообъекты и полимерные нанокомпозиты», МО, г. Химки, Россия, 9-14 октября 2016.]).

1.1. Формирование комплексов микрогель-липосомы. За формированием комплексов следили методами динамического светорассеяния и лазерного микроэлектрофореза. Было определено массовое и числовое соотношение, при котором в смесях микрогель-липосомы не наблюдается агрегация и формируется коллоидно устойчивая система: 30 липосом могут быть адсорбированы на одной частице микрогеля. Теоретическая оценка, основанная на модели Таммеса, когда поверхность большой частицы (микрогель) покрывается маленькими (липосомы) максимально плотным образом даёт для данной системы 45 липосом. Компьютерная симуляция, основанная на случайном заполнении поверхности микрогеля позволяет получить, что только 30 липосом могут быть размещены на поверхности микрогеля. Совпадение симуляции и полученного результата говорит, скорее всего, о статистическом (случайном) характере адсорбции липосом на микрогеле. Насыщенные комплексы, полученные из липосом, содержащих 30 масс% фосфатидилсерина и микрогеля с 10 масс% ДМАПМА диссоциируют при ионной силе буфера 125 мМ. Примечательно, что диссоциация происходит по принципу «всё или ничего»: при значениях ионной силы менее 125 мМ взаимодействие между микрогелем и липосмами есть, а при более высоких значениях взаимодействие отсутсвует вовсе. Кроме того, данное «пороговое» значение ионной силы может быть зафикисровано для комплексов в широком диапазоне соотношений микрогель-липосомы. Таким образом, в будущем необходимо подобрать такой состав системы, чтобы электростатические комплексы микрогель-липосомы были устойчивы при более высоких, физиологически релевантных значениях ионной силы (150-200 мМ). 1.2. Влияние поверхностной плотности заряда микрогеля на свойства комплексов. Увеличение доли групп ДМАПМА с 10 до 20 масс% приводит к быстрому высвобождению загруженного в липосомы доксорубицина сразу после адсорбции. Можно предположить, что такое поведение системы связано с процессами, происходящими в областях контакта макромолекулярных цепей с липидным бислоем; но для более описательных гипотез необходимы дополнительные исследования. Доля протонированных групп ДМАПМА может варьироваться путём изменения pH среды. Интересно, однако, что состав насыщенного комплекса, а также устойчивость комплексов не изменялись в широком диапазоне значений pH от 4 до 9. Таким образом, при рассмотрении взаимодействия микрогель-липосомы нельзя ограничится лишь моделью заряженных сфер; необходимо принимать во внимание протекание обменной реакции между двумя солями: одной, образованной липидом и низкомолеклярным противоионом и второй, образованной протонированной группой ДМАПМА макромолекулы и низкомолекулярным противоионом. 1.3. Влияние плотности поверхностного заряда микрогеля на кинетику высвобождения доксорубицина из комплексов микрогель-липосомы. Микрогель с 20 масс% заряда не мог быть использован в этих исследованиях, так как в случае этого образца наблюдается высвобождение содержимого липосом после адсорбции при комнатной температуре. Варьирование доли поверхностного заряда при помощи pH не позволило бы установить влияние плотности заряда в силу того, что кинетика высвобождения доксорубицина сильно зависит от pH среды. Эти исследования планируется провести на биодеградируемых образцах. 1.4. Механизм индуцирования высвобождения из липосом при коллапсе микрогеля. Одним из самых сущесвтенных результатов выполнения проекта стало следующее важное заключение. Вопреки тому, что в литературе предполагалось, что при коллапсе микрогеля при повышении температуры липосомы сталкиваются друг с другом и поэтому высвобождают своё содержимое, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что высвобождение может происходить и без липосом-липосомального взаимодействия, а обеспечиваться микрогель-липосомальным взаимодействием. Эксериментально получен следующий набор результатов: 1) даже когда комплекс микрогель-липосомы получен в недостатке липосом, при нагреве высвобождается практически всё содержимое адсорбированнх частиц; 2) моделирование показывает, что при коллапсе микрогеля существенная часть липосом не будут сталкиваться друг с другом; 3) взаимодействие липосом с уже коллапсированным микрогелем приводит к мгновенному высвобождению загруженного доксорубицина. Эти данные свидетельствуют, что наиболее вероятно при коллапсе микрогеля осуществляется один из возможных типов микрогель-липосомального (а не липосом-липосомального) взаимодействия, который и приводит к высвобождению.