Исследование бактериолитической активности интерлейкина-2НИР

Study of bacteriolytic activity of interleikin-2

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 25 мая 2015 г.-31 декабря 2015 г. Исследование бактериолитической активности интерлейкина-2
Результаты этапа: Узучена бактериолитическая активность интерлейкина-2 на 35 видах бактерий. Получен генноинженерный препарат интерлейкина-2.
2 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Исследование бактериолитической активности интерлейкина-2
Результаты этапа: Успешно проведена оптимизация рефолдинга рекомбинантного интерлейкина-2. Подобраны условия для очистки препарата интерлейкина-2. интерлейкин-2 получен в активном и стабильном состоянии. Исследована термодинамика сорбции интерлейкина-2 на бактеериальных клетках. Показано, что интерлейкин-2 не сорбируется кдетками lactobacillus plantarum. Клетки Escherichia coli сорбируют интерлейкин-2, при pH 7,0 максимальная сорбционная ёмкость равна 57±11 мкг/мл (8,1*10^-14 г на клетку) и константа десорбции равна 35±11 мкг/мл (2,3*10^-6 M), При pH 8,8 максимальная сорбционная ёмкость равна 100±6 мкг/мл (1,4*10^-13 г на клетку) и константа десорбции равна 15±2 мкг/мл (9,7*10^-7 M).
3 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Исследование бактериолитической активности интерлейкина-2
Результаты этапа: 1. С учетом результатов предыдущего этапа проведена дополнительная оптимизация условий проведения солюбилизации очищенных телец включения, содержащих рекомбинантный интерлейкин-2 (rhIL2), в зависимости от кислотности среды. Показано, что удается увеличить выход солюбилизации при снижении значения рН от нейтральной области до pH=4. Для упрощения очистки рекомбинантного rhIL2 после проведения рефолдинга провели дополнительную стадию очистки rhIL2 в денатурированной форме в солюбилизате методом гель-проникающей хроматографии с использованием ацетатного буфера с добавлением 6 М мочевины и 0,5 М NaCl. Оптимизирована методика проведения рефолдинга (rhIL2) в отсутствие SDS в рефолдинг-среде в две стадии: окисление в денатурирующих условиях и рефолдинг методом разведения. Изучено влияние мочевины, аргинина, дитиотреитола и окисленного глутатиона на процесс рефолдинга. Выходы рефолдинга рассчитаны из данных иммуноферментного анализа полученных препаратов. Разработана методика концентрирования и очистки rhIL2 после рефолдинга с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ. В результате чистота rhIL2 по результатам электрофореза SDS-PAAG составляет более 95% (примеси не проявляются) и отношение поглощений OD280/OD260 составляет более 1.6. Показано, что очищенный и сконцентрированный препарат rhIL2 дикого типа обладает бактериолитической активностью в отношении клеток E.coli, предварительно обработанных хлороформом. 2. Для получения мутатных форм rhIL2 проведен направленный мутагенез с использованием ПЦР. Для этого сконструированы пары дезоксиолигонуклеотидных праймеров (прямой Mfor и обратный Mrev), в которых за счет единичной нуклеотидной замены обеспечивалась необходимая мутация. Получены плазмиды с мутациями в генах, кодирующий интерлейкин-2 в положениях, соответствующих точечным заменам E61D, E61Q, E110D и E110Q. Получены и очищены мутантные формы rhIL2 с заменами E110D и E110Q. Введение данных замен привело к потере бактериолитической активности rhIL2. Возможно остаток E110 участвует в лизисе бактерий как часть активного центра белка или же участвует в поддержании определенной конформации третичной структуры, необходимой для проявления бактериолитической активности. Эксперименты по замене остатка E61 привели к другим результатам: мутантная форма rhIL2 с заменой E61D не экспрессируется в клетках E.coli, а замена E61Q по-видимому приводит к повышению растворимости телец включения. Исходя из этого, остаток E61 представляет интерес для дальнейшего изучения с целью увеличения растворимости rhIL2. 3. Бактериолитические факторы плазмы крови человека. В качестве исходного биоматериала использовалась плазма, полученная из крови стабилизированной цитратом. Стадии очистки включали осаждение сульфатом аммония и хроматографические методы разделения: эксклюзионная хроматография на Sephadex G75 superfine, ионообменная хроматография на Toyopearl 650M DEAE и WorkBeads 40Q и др. Существенной проблемой оказалась инактивация на нескольких стадиях разделения. Для неочищенных препаратов специфичность бактериолитических факторов проверяли на клетках L.plantarum, E.coli и M.luteus. По первым стадиям разделения определено, что в исходном препарате имеются фракции бактериолитических факторов с молекулярными массами 5-6 кДа, 13-18 кДа и 70-80 кДа, однако получении высоко очищенных препаратов для анализа возникли сложности из-за нестабильности препаратов. После применения нескольких вариантов схем очистки отказались от стадий осаждения с помощью сульфата аммония и от добавления в буферные смеси для хроматографических колонок добавок ЭДТА и дитиотриэтола, после стабильность препаратов возросла и повысились возможности охарактеризовать препараты на глубоких стадиях очистки. Методом масс-спектрометрии с трипсинолизом удалось идентифицировать белок массой 70 кДа, который проявлял активность как на E.coli так и на M.luteus. Белок массой 13-18 кДа инактивировался в процессе глубокой очистки. Белок с массой около 6 кДа удалось глубоко очистить, но не удалось идентифицировать масс спектрометрически из-за неоднородности в виду возможного гликозилирования. Для всех препаратов бактериолитических факторов при глубокой очистке наблюдалось существенное занижение аналитического сигнала (30-50%) при определении белка методом Бредфорд по окраске с помощью Coomassie G250 и при проведении электрофоретического разделения и окраске гелей с помощью Coomassie R250, что указывает на наличие гликозилирования. При этом микробиуретовый метод, определяющий концентрацию пептидных связей, и метод Калькарра (поглощение на длине волны 280-260 нм) дают согласующиеся результаты в пределах 15-20% расхождения. 3. Бактериолитические факторы плазмы крови кролика Для плазмы крови кролика после разделения методом гель-проникающей хроматографии определено, что бактериолитическую активность проявляют белки, молекулярные массы которых находятся в следующих диапазонах: 70-75 кДа, 30-35 кДа, 20-25 кДа, 12-15 кДа. Причем бактериолитические факторы массой 70-75 кДа, 30-35 кДа и 12-15 кДа проявляли активность по отношению и к E.coli и M.luteus, а бактериолитический фактор массой 20-25 кДа проявлял активность только по отношению к E.coli. Все изученные факторы имели широкий pH оптимум активности в области значений pH 8-9. При проведении электрофоретического разделения препараты очень плохо прокрашивались вероятно ввиду гликозилирования белков, что приводит к методической сложности вырезания тонких полос из геля для дальнейшего масс-спектрометического анализа. К моменту написания отчета не удалось идентифицировать бактериолитические факторы кролика с применением масс спектрометрии. Для дальнейшего анализа целевых белков требуются бОльшие объёмы биоматериала и усложнение методики с учетом масштабирования, так как относительное содержание бактериолитических факторов невелико на фоне примеси других белков. 4. Бактериолитические факторы плазмы крови карпа Cyprinus carpio. Обнаружено, что в плазме карпа присутствуют следующие бактериолитические факторы： белок массой 70-75, который активен только на клетках L.plantarum, но не активен на других бактериях; белок массой 28-35, активный на и L.plantarum и на E.coli, но неактивен на M.luteus. Идентификация указанных бактериолитических факторов плазмы крови кролика с применением масс спектрометрии является предметом дальнейшего исследования.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".