ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Целью проекта является разработка комплексного подхода, объединяющего возможности системной биологии, биоинформатического анализа, молекулярного моделирования и высокопроизводительных вычислений, для поиска селективных ингибиторов ферментов бактериальных инфекций нижних дыхательных путей (пневмонии и туберкулеза) и создание прототипов новых антибиотиков на их основе.
На первом этапе исследования будет определен круг молекулярных мишеней и выявлены особенности организации функционально важных участков связывания в структурах выбранных ферментов патогенных микроорганизмов. С использованием методов биоинформатического анализа и молекулярного моделирования будет проведена характеристика ранее неизученных участков связывания в структуре ферментов, проведено их распределение по функциональной значимости и выявлены наиболее перспективные участки для связывания потенциальных ингибиторов. Будут определены аминокислотные остатки, определяющие природу и специфичность связывания на отобранных участках. При помощи молекулярного моделирования будет проведен дизайн ингибиторов комплементарных выбранным участкам связывания и созданы фокусированные in silico библиотеки потенциальных ингибиторов. В результате компьютерного скрининга in silico библиотек с использованием построенных молекулярных моделей ферментов будут отобраны наиболее перспективные соединения для экспериментального получения и исследования ингибиторных свойств.
Начата разработка методологии поиска и характеристики ранее неизвестных участков связывания лигандов в структуре ферментов, оценки их функциональной значимости
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 26 мая 2015 г.-15 декабря 2015 г. | Изучение особенностей структурной организации центров связывания в ферментах патогенов и разработка новых антибиотиков для лечения заболеваний нижних дыхательных путей с использованием системных подходов биоинформатики и молекулярного моделирования |
Результаты этапа: В 2015 г. был разработан и апробирован комплексный подход, объединяющий возможности системной биологии, биоинформатики, молекулярного моделирования, теоретической химии и высокопроизводительных вычислений, для поиска ранее неизвестных участков связывания в структуре ферментов и оценки их функциональной значимости. Были получены расчетные и экспериментальные результаты, подтверждающие правильность выбранной концепции. В соответствии с разработанной методикой был проведен биоинформатический анализ и поиск in silico ранее неизвестных участков связывания для суперсемейств ферментов ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗ, ТРАНСКЕТОЛАЗ, БАКТЕРИАЛЬНЫХ НЕЙРАМИНИДАЗ, L,D-ТРАНСПЕПТИДАЗ, ДНК-ЗАВИСИМЫХ РНК-ПОЛИМЕРАЗ. Для поиска лигандов, способных связываться в ранее известных и новых участках связывания выбранных ферментов, выбранных на основании результатов биоинформатического анализа, проводили компьютерный скрининг фокусированных in silico библиотек соединений, учитывающих особенности механизма действия и структурной организации выбранного участка связывания каждого фермента. Для изучения механизма взаимодействия ферментов с наиболее перспективными соединениями, отобранными в результате компьютерного скрининга библиотек, использовали молекулярную динамику. Проведенное моделирование позволяло уточнить тонкие детали механизма связывания и выявить пути дальнейшей оптимизации структуры ингибиторов. Наиболее перспективные ингибиторы бактериальных ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗ, ТРАНСКЕТОЛАЗ и L,D-ТРАНСПЕПТИДАЗ были исследованы экспериментально. Экспериментальное исследование показало, что соединения ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ, отобранные на основании компьютерного исследования, обладают заметным ингибирующим действием на фермент из микобактерий, не оказывая существенного влияния на человеческий гомолог. Анализ литературы и базы данных DrugBank показал, что свойство обнаруженных нами соединений как ингибиторов ГАФД продемонстрированно нами впервые. Было проведено молекулярное моделирование комплексов ГАФД с лучшими ингибиторами, структуры оптимизированы с использованием методов молекулярной динамики, что помогло уточнить механизм связывания низкомолекулярного соединения. Показано, что селективность действия ингибиторов обусловлена наличием специфических позиций в новом сайте-мишени, обнаруженном с помощью биоинформатического анализа. Полученные результаты позволяют говорить о том, что обнаруженный нами новый сайт связывания в структуре ГАФД из Mycobacterium tuberculosis является перспективной мишенью для создания селективных ингибиторов, а структура полученных лидерных соединений будет оптимизирована для увеличения ингибирующего эффекта. Активность предложенных ингибиторов ТРАНСКЕТОЛАЗЫ была изучена экспериментально по отношению к ферментам из бактерий и дрожжей. Проведенные исследования показали, что отобранные соединения проявляют умеренную ингибирующую активность. Наиболее эффективные из исследованных нами ингибиторов ГАФД, L,D-транспептидазы и транскетолазы будут исследованы для определения их активности по отношению к патогенным микобактериям. | ||
2 | 1 января 2016 г.-15 декабря 2016 г. | Изучение особенностей структурной организации центров связывания в ферментах патогенов и разработка новых антибиотиков для лечения заболеваний нижних дыхательных путей с использованием системных подходов биоинформатики и молекулярного моделирования |
Результаты этапа: Разрабатываемый подход, основанный на применении методов биоинформатики и системной биологии и ставящий своей целью определение ранее неизвестных участков связывания, существенных для функционирования ферментов, получил в 2016 году дальнейшее развитие, апробацию и экспериментальное подтверждение на примере глицеральдегид-3-дегидрогеназ и транскетолаз. В обоих случаях были выявлены ранее неизвестные участки связывания в структуре ферментов и найдены комплементарные к ним низкомолекулярные лиганды, способные избирательно ингибировать ферменты микроорганизмов, не подавляя активности гомологичных ферментов человека. Проверка влияния наиболее эффективных ингибиторов глицеральдегид-3-дегидрогеназы, транскетолазы и L,D-транспептидазы, отобранных по результатам компьютерного моделирования и экспериментальной проверки их ингибирующей способности по отношению к ферментам-мишеням, показала подавление роста культуры Mycobacterium tuberculosis. Установлена противотуберкулезная активность по крайней мере пяти предложенных соединений. Таким образом, были получены доказательства перспективности использования разрабатываемой методологии для поиска ингибиторов с ранее неизвестным механизмом действия для разных ферментов. Полученные результаты создают основу для оптимизации структур предложенных соединений и доказывают перспективность выбранного пути поиска новых антибиотиков. В 2016 г. усовершенствована методология поиска и характеристики новых участков связывания в структуре ферментов, оптимизирован протокол ее применения. Использование суперкомпьютера позволило увеличить производительность процедуры и проводить анализ больших библиотек ингибиторов с более высокой точностью, достигаемой за счет использования более аккуратного и ресурсозатратного алгоритма оценки энергии связывания, а также усовершенствования процедуры скрининга. Принципиальным дополнением разрабатываемой методологии, было усовершенствование стадии поиска комплементарных ингибиторов для конкретного участка связывания. Разработан метод скрининга библиотек ингибиторов, учитывающий взаимодействия соединений-кандидатов с аминокислотными остатками участка связывания, расположенными в специфических позициях подсемейств. Таким образом, роль специфических позиций подсемейств, выбранных нами ранее в качестве одного из ключевых критериев идентификации и ранжирования функциональных и регуляторных центров в структурах белков, была расширена на стадию определения структуры селективных ингибиторов. | ||
3 | 2 января 2017 г.-15 декабря 2017 г. | Изучение особенностей структурной организации центров связывания в ферментах патогенов и разработка новых антибиотиков для лечения заболеваний нижних дыхательных путей с использованием системных подходов биоинформатики и молекулярного моделирования |
Результаты этапа: Задачи проекта на 2017 год выполнены полностью. Проведен критический анализ результатов, полученных за время выполнения проекта, что позволило провести оптимизацию разрабатываемой методологии и разработать усовершенствованную процедуру поиска участков связывания и комплементарных этим участкам селективных ингибиторов ферментов. Критический анализ полученных результатов и накопленного опыта показали, что для эффективной реализации идеи и методологии данного проекта, т.е. поиска ранее неизвестных участков связывания в структуре ферментов (в том числе ферментов патогенов), изучения особенностей их структурной организации в ферментах суперсемейства, выбора наиболее функционально важных участков и создания селективных ингибиторов, способных связываться на этих участках в конкретном ферменте, необходимо дальнейшее развитие методов биоинформатики и обеспечение их оптимального сочетания с методами молекулярного моделирования. Для этой цели в 2017 году была завершена разработка эффективно работающей программы, позволяющей выйти на структурно-опосредованные выравнивания тысяч белков/ферментов, и создан соответствующий веб-сервер (https://biokinet.belozersky.msu.ru/mustguseal). Наряду с этим, существенным дополнением разрабатываемого метода явился учет роли коэволюционирующих позиций (позиций, эволюционно связанных со специфическими позициями подсемейств), которые участвуют в формировании сети взаимодействий, определяющих взаимосвязь и роль отдельных участков связывания в структуре ферментов. Был создан соответствующий веб-сервер (https://biokinet.belozersky.msu.ru/visualcmat). Разрабатываемый подход выходит за рамки частной задачи поиска ингибиторов нескольких конкретных ферментов патогенов, и по своим возможностям представляет общую методологию дизайна лекарств. Принципиально важным достижением экспериментальной части работы в 2017 году было использование очищенных ферментных препаратов глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, транскетолазы и L,D-транспептидазы из Mycobacterium tuberculosis. На предыдущих этапах при экспериментальном изучении ингибиторов использовали препараты гомологичных ферментов: глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы из Mycobacterium smegmatis и транскетолазы из дрожжей. Проведенные экспериментальные исследования показали, что наиболее перспективные ингибиторы, отобранные в результате компьютерного скрининга, были эффективны как по отношению к глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназе и транскетолазе из Mycobacterium tuberculosis, так и по отношению к гомологичным им глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназе из Mycobacterium smegmatis и транскетолазе из дрожжей. Проведена оптимизация структуры ингибиторов глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, транскетолазы и L,D-транспептидазы и определены структуры соединений, обладающих наилучшими характеристиками по сочетанию эффективности ингибиторного действия и способности подавлять рост возбудителя туберкулеза. При компьютерном прогнозировании фармакокинетических свойств и токсичности разработанных ингибиторов транскетолазы, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы и L,D-транспептидазы показана безопасность разработанных ингибиторов, что позволяет планировать предварительные исследования на животных моделях, а также обосновать выбор подходящих доз. В 2017 году был проведен синтез ряда лидерных соединений – ингибиторов L,D-транспептидазы, рекомендованных в результате компьютерного моделирования и скрининга, для экспериментального изучения ингибиторных свойств. Проведен дизайн ингибиторов второго поколения для ДНК-зависимой РНК-полимеразы и бактериальной нейраминидазы, определены наиболее перспективные соединения для дальнейшего экспериментального исследования. Исследован механизм действия обнаруженных ингибиторов по отношению к транскетолазе из Mycobacterium tuberculosis, проведен анализ взаимосвязи структуры и активности соединений. Методами компьютерного прогнозирования предсказаны фармакокинетические свойства и токсичность разработанных ингибиторов транскетолазы, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы и L,D-транспептидазы. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".