ИСТИНА

Аптамеры на основе нуклеиновых кислот – перспективные молекулярные узнающие элементы для терапии и диагностики социально-значимых заболеваний, а также для создания аптасенсоров для детекции субстанций различной природы. Аптамеры представляют собой олигонуклеотиды длиной в несколько десятков нуклеотидов с уникальной пространственной структурой. Уникальная пространственная структура аптамера топологически комплементарна участку поверхности мишени, что позволяет специфически и высокоаффинно связывать мишень, в том числе в различных средах, например, в биологических жидкостях и in vivo. По своему действию аптамеры аналогичны антителам, однако простота химического синтеза, сборки структуры и низкая токсичность аптамеров дают им весомые преимущества в сравнении с антителами. В настоящее время известны сотни разных аптамеров к разным мишеням, включая клетки, белки и низкомолекулярные соединения; количество аптамеров растет экспоненциально из года в год. Аптамеры в качестве узнающих элементов - более технологичное решение, чем используемые в настоящее время антитела, поскольку аптамеры обладают большей стабильностью и могут быть разработаны к любой мишени, включая токсичные вещества и естественные метаболиты. Развитие сенсоров на основе аптамеров позволит создавать более стабильные и дешевые экспресс-системы, например, для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний и токсических веществ. Низкая чувствительность современных методов диагностики ограничивает их применение, когда содержание патогенов в клиническом образце достаточно мало. Применение высокочувствительных методов диагностики, например, ИФА или ПЦР, возможно только для специально оборудованной лаборатории. Данный проект направлен на решение нескольких фундаментальных и прикладных проблем, важных для создания чувствительных и достоверных тест-систем на основе аптамеров. В качестве основного метода детекции мишени при связывании с аптамером выбрана высокочувствительная и экспрессная технология поверхностно - усиленного рамановского рассеяния (SERS, Surface Enhanced Raman Scattering), позволяющая добиться усиления сигнала в рядовых случаях в 10^6 раз, а в случае упорядоченных периодических массивов наночастиц – до 10^9 раз. Столь высокая чувствительность делает возможным детектирование считанного числа сорбированных молекул. Сочетание SERS как метода детекции и аптамеров в качестве узнающих элементов – новая область, которая только начинает развиваться. Именно поэтому для достижения высокой чувствительности и воспроизводимости тест-систем необходимо создание теоретических основ и проведение поэтапных работ по оптимизации SERS-систем на основе аптамеров. Подложки и коллоидные наночастицы, позволяющие получать ультравысокую чувствительность в SERS, могут быть представлены различными металлами, такими, как серебро, золото, алюминий или медь. Поэтому важной задачей проекта является выбор способа иммобилизации аптамеров на поверхности металла, выбор оптимальной длины линкера, оптимизация условий иммобилизации, обеспечивающих сохранение специфической пространственной структуры аптамеров. Одной из задач проекта является оптимизация SERS-структур под разные длины волн возбуждающего излучения для достижения максимальной чувствительности метода. Предлагается использовать планарные подложки с оптимизированной геометрией, коллоидные наночастицы и многослойные SERS-подложки. Для получения гигантских сигналов оптического отклика (условие детекции единичных молекул аналита) будут использованы комбинированные плазмонные и диэлектрические резонаторы. Кроме подстройки плазмонных и диэлектрических резонансов под длину волны лазера будет произведен подбор оптимального SERS-репортера, имеющего наиболее высокую вероятность рамановского рассеяния света и/или квантовый выход флюоресценции. Таким образом, изучение эффектов для ряда параметров, таких как длина волны возбуждающего излучения, тип подложек и металлических наночастиц, тип молекулы-репортера, сделает возможным выбор оптимальных условий для проведения тестов. Следующая задача проекта – изучение условий связывания аптамеров с мишенью в растворе и биологических жидкостях, условий фиксации специфических комплексов, введение специальных меток, способных при облучении определенной длиной волны резонировать с SERS-подложками, увеличивая чувствительность метода. Цель проекта – разработать принципиально новую технологию детекции, которая отличается быстрой и простой процедурой проведения анализа, высокой чувствительностью и специфичностью, возможностью подстройки системы для детекции различных субстанций (бактерий, вирусов, низкомолекулярных соединений), а также компактностью оборудования, простым пользовательским программным обеспечением и возможностью проведения анализов во внелабораторных условиях. Детекция будет проводиться с применением малогабаритной аппаратуры нового поколения – раман-флуоресцентных комплексов. В рамках проекта будут созданы прототипы детекторов к биологическим объектам принципиально разной природы и разного масштаба: вирусы гриппа, линии раковых клеток и низкомолекулярные соединения (на примере аденозина и его производных). Для детекции вирусов гриппа будут использованы аптамеры к гемагглютинину – поверхностному белку вируса, отвечающему за первичное узнавание клетки-хозяина. Для детекции раковых клеток будут использованы аптамеры к EGFR – рецептору, экспрессированному во многих типах рака, особенно в глиобластоме, раке легкого и проч. В качестве модельного объекта низкомолекулярного соединения выбран аденозин и его производные, для которых описаны аптамеры и разнообразные тест-системы с разной чувствительностью, что позволит провести сравнительный анализ прототипа тест-системы на основе SERS. В целом, проект направлен на внедрение аптамеров в качестве узнающих элементов сенсоров, развитие общей методологии SERS в приложении к биологическим молекулам и объектам. В дальнейшем полученные в рамках проекта результаты будут использованы в качестве методологической базы для создания экспериментальных высокочувствительных тест-систем для идентификации биологических объектов разной природы, таких как патогены, раковые клетки, метаболиты, опасные вещества.

В рамках проекта будут созданы прототипы SERS-детекторов на основе НК-аптамеров к биологическим объектам принципиально разного масштаба: вирусам, клеткам и низкомолекулярным соединениям. Пошаговая оптимизация этапов создания SERS-подложек, иммобилизации аптамеров, связывания мишени и удаления неспецифически связавшихся объектов, усиление сигнала и специфичности узнавания за счет связывания со вторичными флуоресцентно меченными аптамерами (по аналогии с сэндвич-методом ИФА) позволят добиться качественно нового результата в этой области: будет разработана высокочувствительная методика, адаптируемая под аптамеры к любым мишеням. Адаптируемость метода к разным объектам - ключевая особенность проекта, отличающая проект от аналогов, описанных в литературе. Возможность менять аптамер, сохраняя методику в целом, позволит в дальнейшем оперативно создавать высокочувствительные детекторы для разных биологических объектов. Высокочувствительные SERS-детекторы на основе аптамеров могут быть использованы для идентификации возбудителей инфекционных заболеваний, типирования клеток и выявления онкомаркеров, детекции опасных веществ, например, взрывчатых или наркотических веществ. В перспективе такие оптические сенсоры могут быть широко и успешно использованы в различных областях медицины, промышленности и народного хозяйства. На основе данной технологии в дальнейшем могут быть созданы сверхчувствительные и дешевые методы SERS-детектирования и контроля опасных веществ в воде, воздухе и биологических жидкостях, что позволит сильно удешевить анализы за счет исключения большого количества реактивов и сред, а также сложного лабораторного оборудования. Это позволит проводить анализы во внелабораторных условиях, повысит скорость получения ответа и будет способствовать предупреждению эпидемиологически опасных ситуаций. Ожидается, что выполнение проекта обеспечит достижение новых научных и прикладных результатов международного уровня благодаря плодотворному взаимодействию специалистов в области биохимии, молекулярной биологии, наноплазмоники, спектроскопии и современных биотехнологий. Разработка и внедрение в дальнейшем этой технологии позволит решать актуальные проблемы во многих сферах - здравоохранении, экологии, безопасности.