Высокопроизводительный поиск веществ, селективно токсичных против опухолевых клеток молочной железы и легкого, и ингибирование GCPII как новой специфической мишени в онкоангиогенезе.НИР

High-througput screening of substances, that are selectively toxic against tumor cells of a mammary gland and lung, and GCPII inhibition as a new specific target in tumor neovscularisation

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 26 июля 2018 г.-26 июля 2019 г. Высокопроизводительный поиск веществ, селективно токсичных против опухолевых клеток молочной железы и легкого, и ингибирование GCPII как новой специфической мишени в онкоангиогенезе
Результаты этапа: Запланированные задачи полностью выполнены. Разработаны модели для высокопроизводительного тестирования; проверено свыше четырех тысяч препаратов (при плане 2000-4000) обнаружено 19 лидерных соединений; проведены запланированные исследования de novo синтезированных соединений; анализ ингибиторов GCPII и пилотное тестирование их влияния на ингибирование ангиогенеза: 1) Сконструированы флуоресцентно-меченые клеточные линии клеточные линии рака молочной железы MCF7 и неопухолевых клеток эпителия молочной железы MCF10A с постоянной экспрессией флуоресцентных белков. Сделана модель опухоли молочной железы с микроокружением на основе сокультивируемой пары флуоресцентных клеточных линий MCF7_EGFP и MCF10A_Katushka2S. В представленной модели клетки растут кластерами со взаимным вытеснением в зависимости от состава культуральной среды и добавляемых препаратов. Модель адаптирована к высокопроизводительному тестированию в 384-луночном формате. В том числе решены технические задачи по составу среды (80%F12/20%M10A), подбору соотношения числа клеток (500/700), продемонстрирована эффективная детекция обеих клеточных линий при сканировании высокого разрешения. На основе ранее сделанных линий разработана модель 549_EGFP/VA13_Katushka2S для поиска селективно цитотоксичных против линии карциномы легкого соединений и адаптирована к 384-луночному формату анализа. 2) В модели A549_EGFP/VA13_Katushka2S протестировано 4126 соединения, включающих в себя коллекции рандомизированных соединений синтетического и природного происхождения, включая 767 соединений с предсказанной in silico нашими коллегами возможной противоопухолевой активностью. Для 54 хитов, полученных при анализе первых трех тысяч соединений проведена верификация селективной цитотоксичности по Мосману, подтвеждена селективность 19 соединений. 67 хитов обнаружено при анализе соединений с предсказанной in silico активностью, их действие пока не верифицировано. Несмотря на больший выход хитов, и, в среднем, несколько большую эффективность хитов обогащенной in silico коллекции, значительная часть из них попадает под патентные ограничения при анализе аналогов в базах данных. Поэтому, несмотря на более низкий выход, будет продолжен скрининг рандомизированных коллекций, но уже в обеих разработанных моделях. Запланированные на следующий год к тестированию аналоги относятся в первую очередь к найденным оригинальным каркасам. 3) При анализе de novo синтезированных соединений обнаружено, что биологическое действие ферроценовых производных отличается от действия исследованных ранее производных 2-тио-имидазол-4-онов. В случае последних, цитотоксичность обуславливалась эффектами меди, а лиганд мог выступать как молекула-транспортер. В опубликованной ранее работе по комплексам меди цитотоксичность десятков комплексов всегда была выше чем у индивидуальных лигандов [2]. Также, при анализе в отчетном году аминопроизводного 2-тио-имидазол-4-онов его CC50 составляет десятки микромоль. Выживание клеток в присутствии 100 мкМ Cu(II) было свыше 50%. При тестировании того же лиганда в присутствии 100 мкМ Cu(II) СС50 снижалось более чем на порядок, что мы объясняем многораундовым транспортом меди в клетку этим лигандом (неопубликованные данные). Ферроценсодержащие имидазолоны (5 и 6 из [1]) и их медные комплексы также были протестированы на их цитотоксическую активность in vitro против клеток карциномы MCF-7 и A-549, а также против нераковой клеточной линии Hek-293. Результаты показали умеренную цитотоксичность комплексов но СС50 одного из лигандов на порядок превышал действие соответствующего комплекса [1]. Ингибирование теломеразы, показанное ранее для гомологов тестируемых препаратов для исследованных комплексов оказалость очень слабым. Была продемонстрирована способность исследованных медных комплексов соединений вызывать деградацию ДНК и способность лиганда 6 вызывать апоптоз клеток [1]. Было исследовано свыше 50 ди- и три-арил производных тиогидантоина как потенциальные активаторы Р53 каскада. Три-арил производные активности не проявили. Синтезированная нашими коллегами библиотека из 38 диарильных производных 5-арилиден-2-тиогидантоинов была исследована in silico на предмет потенциальных мишеней, in vitro для анализа цитотоксичности и активности в отношении двух опухоль-ассоциированных молекулярных мишеней: пути Р53 и андрогенного рецептора (АР). К сожалению, ингибирование АР происходило при концентрациях препаратов 10-15 мкМ, близком или пересекающимся с диапазоном цитотоксических концентраций тестируемых веществ, что не позволяет говорить о селективности действия. При этом, в раннем микромолярном диапазоне концентраций два соединения вызывали активацию АР, на основании in vitro тестов и данных моделирования предположен аллостерический механизм регуляции. Еще один препарат ведет к значительной активации каскада Р53. На основании полученных данных можно предположить, что активация P53 была вызвана взаимодействием с его негативным регулятором MDM2. 2-тиогидантоин-S-арилидены могут быть предложены в качестве перспективного каркаса для синтеза библиотек биологически активных соединений [статья отослана в редакцию, см. Приложение 1]. Для этого класса соединений предложена дальнейшая модификация в двух направлениях: дальнейшая оптимизация заместителей и модификация 1-арилиден или 4-оксо положений для снижения возможных побочных эффектов от предсказанной хемоинформатически неспецифической модификации белков и увеличения специфичности. 4) Был проведен анализ синтезированных ранее в работе наших коллег лигандов GCPII, разработанных ранее для адресной доставки в опухоли простаты на основе Glu-urea-Lys цинк-связывающего домена с дополнительными фрагментами, обеспечивающими предположительно дополнительное взаимодействие в гидрофобном кармане, аргининовом тракте и арил-связывающем сайте GCPIIю. Четыре отобранных препарата третьего поколения из скрининга (таблица 1 Приложения 2) были отобраны для тестирования антиангиогенного потенциала в анализе образования сосудоподобной сети. Кроме того, тестировались ингибиторы, содержащие только ядро (препарат 14) или ядро с одной из двух дополнительных взаимодействующих групп GCPII (препараты 15, 16). Результаты сравнения наших данных и опубликованных в литературе данных о других соединениях говорят о том, что отобранные препараты относятся к наиболее перспективным по эффективности ингибирования PSMA (полный анализ см. в приложении 3).Добавление ингибиторов GCPII в концентрации 2-50 мкМ к клеткам HUVEC, культивируемым на матрице Matrigel, приводит к явной дезорганизации клеточной сети с уменьшением количества и разветвленности сосудоподобных структур (Пример медианной по значениям биологической реплики приведен на Рис 1A Приложения 2). К сожалению, после обработки HUVEC соединениями разброс эффектов в биологических репликах составляет 20-70%. Сильный межэкспериментальный разброс данных, предположительно связанный с вариацией состава сыворотки и комплексных компонентов среды усложняет количественное сравнение между образцами. В связи с полученным разбросом данных проекта в этой части был скорректирован. В настоящий момент ведутся работы по разработке модели, лучше отражающей именно ингибирование GCPII. В частности, будут использованы среды с добавлением прекурсоров препаратов проангиогенного пептидида и глутамата, основываясь на данных [3]; проверяются литературные данные об увеличении экспрессии GCPII в эндотелиальных клетках HUVEC при обработке их кондиционной средой от некоторых опухолевых клеточных линий [4]. 5) Подготовлены три публикации по проведенным работам: одна опубликована (прикреплена к проекту), вторая находится на рассмотрении в редакции (прикреплена к отчету в качестве приложения 1), третья – обзор ингибиторов GCPII, находится на корректировке английского для подачи в журнал, (прикреплена к отчету в качестве приложения 3). [1] Guk D.A. et al. New ferrocene-based 2-thio-imidazol-4-ones and their copper complexes. Synthesis and cytotoxicity, Dalton Transactions, 47, с. 17357-17366 [2] Majouga AG, Zvereva MI, Rubtsova MP, et al. (2014) Mixed valence copper(I,II) binuclear complexes with unexpected structure: synthesis, biological properties and anticancer activity. J Med Chem 57:6252-6258. [3] Conway RE, Rojas C, Alt J, et al. (2016) Prostate-specific membrane antigen (PSMA)-mediated laminin proteolysis generates a pro-angiogenic peptide. Angiogenesis 19:487-500. [4] Nguyen DP, Xiong PL, Liu H, et al. (2016) Induction of PSMA and Internalization of an Anti-PSMA mAb in the Vascular Compartment. Mol Cancer Res. 2016 Nov;14(11):1045-1053
2 27 июля 2019 г.-26 июля 2020 г. Высокопроизводительный поиск веществ, селективно токсичных против опухолевых клеток молочной железы и легкого, и ингибирование GCPII как новой специфической мишени в онкоангиогенезе
Результаты этапа: С помощью разработанных в начале проекта оригинальных системах тестирования было проанализированосвыше 4000 соединений, в том числе 380 гомологов селективно цитотоксичных соединений, найденных в ходе выполнения первого года проекта. Ряд найденных препаратов в модели РМЖ (STOCK1N-26280, STOCK5S-41129, STOCK2S-25911) достигали селективности в диапазонах от 2.1 - 42.5 mg/l до 0.1-10.6 mg/l, оказались относящимися к известному классу кумариновых производных, запатентованному как противоопухолевые [US8058427], а соединение STOCK1S-60666 с селективностью в диапазоне 0.4-42.5 mg/l ранее было запатентовано как антимитотическое соединение [US2005095197]. Лучшим в модели РЛ был бензимидазол STOCK6S-21039 с селективностью 2.1-10.6 mg/l, он также относится к группе запатентованных соединений с активностью против NSCLC [US9212169]. Найденные соединения бензиламино-хиназолинового ряда (например, 8F09#31302) не имеют данных о биоактивности или патентах в БД Pubchem, но имеют общие структурные элементы с основанными на хиназолинах ингибиторами киназ. Далее будут рассматриваться вместе с лидерами по селективности группы предсказанных киназных ингибиторов. Была изучена избирательная цитотоксичность и проверено влияние на ДНК ряда новых металлокомплексов на основе гидантоинов, в том числе производных , чье влияние на клетки смещается из микромолярноых концентраций, типичных для данного класса в область низких наномолярных концентраций. Ингибиторы PSMA, к сожалению, не оказали ингибирующего действия в наномолярном/раннем микромолярном на образование сосудоподобных структур клетками HUVEC, а наличие пертидов LQ/LQE не меняло значимо образование сосудоподобных структур. Было обнаружено, что некоторые найденные структурно и биохимически разные соединения, вероятно имеют общую биохимическую мишень как основу для селективности. Так, препараты 62е2, селективный на пол порядка против клеток эпителия легкого A549 по сравнению с действием на фибробласты VA13 и 3B03#31302, на порядок менее цитотоксичное против фибробластов VA13, чем против опухолевых клеток эпителия легкого A549 не имеют данных о биоактивности в базе данных Pubchem и не имеют структурной гомологии. При этом анализ структуры 3B03#31302 показывает, что это гомолог ротенона, ингибитора митохондриального комплекса I. А изучение 62e2, относящегося к делокализованным катионам, оценка его клеточной локализации и изменения морфологии митохондрий показало, что его эффекты объясняются скорее всего поражением мембраны митохондрий. То есть, оба препарата поражают митохондрии.
3 27 июля 2020 г.-1 марта 2022 г. Высокопроизводительный поиск веществ, селективно токсичных против опухолевых клеток молочной железы и легкого, и ингибирование GCPII как новой специфической мишени в онкоангиогенезе
Результаты этапа: В первые два года проекта в ходе скрининга порядка 5000 соединений природного происхождения и их производных, а также соединений с in silico предполагаемой противоопухолевой активностью было найдено свыше 100 соединений с избирательной цитотоксичностью in vitro в первичных тестах. В прошедшем году из них проводился отбор и анализ лидерных соединений. Кроме того, было проанализировано несколько кластеров веществ, среди которых неоднократно встречались селективные соединения. Была исследована цитотоксичность и избирательность действия группы инденофлуоренов, а для оценки возможного действия на другие типы опухолевых клеток для лидерного препарата группы (65D08) было проведено исследование его действия на опухолевые клетки различной этиологии. Повышенная цитотоксичность лидерного соединения группы инденофлуоренов (65D08) по сравнению с иммортализованными фибробластами наблюдается для линий клеток рака молочной железы MCF7, тройного негативный рака молочной железы MDA-MB-231, фибросаркомы HT1080, рака простаты PC3 и колоректального рака HCT116, глиобластомы U87. Стоит отметить, что высокая селективность в 10-139 раз наблюдалась против клеток линии LNCAP рака простаты, что позволяет говорить о возможной высокой селективности данного соединения против некоторых типов опухолевых клеток. Близкие структурные аналоги соединения 65D08 не описаны как известные или потенциальные противоопухолевые препараты. При обработке этим препаратом меняется экспрессия нескольких белков, отвечающих за свертку белков, в том числе уровень некоторых шаперонов, но пока не ясно, причина это или следствие стресса клеток при гибели. Анализ действия препарата 65D08 показывает как цитотоксический, так и цитостатический эффекты в зависимости от концентрации препарата и времени обработки. Так в тестах выживаемости за 72 часа наблюдалась полная гибель клеток, что соответствует цитотоксическим эффектам. При оценке влияния препарата на клеточный цикл было обнаружено накопление клеток в G1 фазе, что отражает возможный цитостатический эффект препарата. Ещё одним лидерным соединением из коллекции в сокультуре A549 /VA13 являлось вещество “7018” с более чем двухкратной разницей выживаемости A549’ и VA13 в сокультуре в широком диапазоне концентраций 0.7-18 мкМ. Его определенные стандартным тестом по Мосману в монокультурах CC50(А549’)=0.17±0.02 мкг/мл и CC50(VA13)=0.67±0.19 мкг/мл, что соответствовало селективности в сокультурах. Интересно, что хотя селективность в сокультуре MCF7/MCF10A наблюдалась лишь на одной концентрации, в монокультурах индекс селективности “ 7018” составлял более десяти (CC50(MCF7)=0.14±0.03 мкг/мл и CC50(VA13)=0.67±0.19 мкг/мл). При тестировании в расширенной панели из десяти клеточных линий наименьшую цитотоксичность это соединение проявляло против вышеупомянутых VA13 и MCF10A, наибольшую к MCF7, а также СС50~0.3-0.4 мкг/мл наблюдалась для линии РМЖ MDA-MB-231, линии клеток колоректального рака HCT116 и клеток рака простаты 22RV1. Соединение “7018” не влияло на клеточный цикл не изменяя соотношение клеток в G1/S/G2 фазах за 24 часа даже в концентрациях, превышающих СС50 (последний рассчитывался для 72 часовой обработки препаратом). Анализ жестких структурных фрагментов соединения “ 7018” показывал высокую степень гомологии с комбретастатинами (структура выглядит как две несколько модифицированные молекулы комбретастатина, коньюгированные в единый цикл). Поэтому препарат был проверен на действие на полимеризацию тубулина. В сравнении с клетками без обработки и обработкой клеток комбретастатином А4 не наблюдалось значимой деполимеризации тубулина под действием “ 7018”. Наиболее вероятной мишенью этого соединения является ДНК-топоизомераза 2b (pval = 6.17E-08 по анализу SEA - ансамбля сходства - in silico сопоставления белков-мишеней на основе химического сходства множества их лигандов). При этом коэффициент Танимото всего 0.3 с ближайшим по структуре индивидуальным лигандом ДНК-топоизомеразы 2b говорит об оригинальности описываемого соединения. У соединения “ 7018” нет близких аналогов в химколлекциях, его синтез, пока предложенный готовыми к сотрудничеству группами оргсинтеза включал восемь стадий и работу с высокотоксичными производными, что было признано неперспективным. Дальнейшее развитие исследований этой молекулы будет направлено на поиск более оптимального пути синтеза и поиск его биоизостеров. Селективность в широком диапазоне концентраций показывали также две группы соединений из коллекций направленного синтеза для которых также предполагалось взаимодействие с тубулином. Первая из них - это группа N-метоксифенил-тетрагидрохиназолинаминовых производных. Их рейтинг, определяемый диапазоном селективности, в модели A549/VA13 достигал четырех. Селективность действия этих соединений оказалась ожидаемой, так как они синтезировались как лиганды тубулина и обработка ими должна была приводить к нарушениям организации цитоскелета, что более чувствительно для быстроделящихся опухолевых клеток. При проверке в ретесте в монокультурах по протоколу МТТ оказалось что несколько лидерных соединений (av1200, av1451) действительно лишь частично снижали количество клеток VA13, но практически полностью угнетали выживаемость быстро делящихся клеточных линий. Вторая исследованная группа – это аналоги комбретастатина А4, которые были направлены на повышение растворимости и стабильности комбретастатинов. Соединение “352” из аналогов комбретастатина но с фиксацией структуры изоксазолом вместо двойной связи в исходной структуре - вызывало нарушения организации тубулина, полностью аналогичные CA4. Соединения av1200 и av1451 также вызывали характерные нарушения морфологии клеток. Лидерным соединением, проявлявшим селективность в обеих моделях после первых этапов отбора был препарат “24653”. Его эффекты воспроизводились в МТТ тесте, а после тестирования в расширенной панели из 11 клеточных линий наиболее чувствительными были клеточные линии тройного негативного рака молочной железы MDA-MB-231 и линия рака простаты PC3, СС50 для которых составлял 0.12 мкг/мл что обеспечивало примерно стократную селективность по сравнению с линией VA13, СС50 для которых составлял 18.6 мкг/мл. Это соединение вызывало апоптоз в клетках в концентрациях до 1 мг/л за сутки. После анализа структуры, оказалось, что наиболее вероятной (pvalue 10^-57) мишенью является первый комплекс дыхательной цепи, так как гомологом этого соединения оказался ротенон, являющийся инсектицидом и известным токсикантом. Проверенный нами в FCCT тесте ротенон также показал слелективность в наших клеточных моделях, хотя и несколько меньшую чем 24653, что снижает ценность последнего как потенциального противоопухолевого препарата из-за вероятного малоспецифического механизма действия. В ходе предыдущего скрининга пять молекул с не самой высокой, но достоверной избирательной цитотоксичностью попали в один и тот же структурный кластер (кластер 953) из пятидесяти шести молекул, что позволило строить связь структура-активность. Помимо поиска значимых дескрипторов, приведших, например, к липофильности, влияющей на проникновение в клетку, был проведен фрагментный анализ молекул, для чего молекула была in silico разобрана на жесткие фрагменты и каждому фрагменту молекулы присваивался рейтинг в соответствии с селективностью молекул в состав которых они входили. Такой подход позволил увеличить долю селективных молекул в дозаказанной серии соединений, хотя и не позволил обнаружить заметно более селективные производные. Данный кластер представляет интерес, поскольку при детектируемой и воспроизводимой селективности в сокультуре у некоторых из селективных препаратов низкая цитотоксичность в монокультурах клеточных линий. Перспективным представляется поиск и проверка биоизостеров лидерных соединений этой группы соединений. Ещё один кластер селективных молекул (номер 49) состоял из тринадцати молекул, из которых четыре были избирательно цитотоксичны, что позволило строить связь структура-активность. Был проведен фрагментный анализ молекул, для чего молекула была in silico разобрана на жесткие фрагменты и каждому фрагменту молекулы присваивался рейтинг в соответствии с селективностью молекул в состав которых они входили. Такой подход позволил увеличить долю селективных молекул в дозаказанной серии соединений, но не позволил обнаружить заметно более селективные производные. Интересно, что для лидерного соединения этого кластера есть описанная молекулярная мишень – АТФ-зависимый транспортер ABCG2, этот белок функционирует как переносчик ксенобиотиков, который может играть важную роль в развитии множественной лекарственной устойчивости в раке молочной железы. Перспективным представляется не только поиск и проверка биоизостеров лидерных соединений этой группы соединений, но и дальнейшее исследование этого препарата в сокультурах в комбинации с известными химиотерапевтическими молекулами для поиска синергии. В скрининге в качестве ещё одного кластера соединений-лидеров были выделены молекулы STOCK1N-36111, STOCK1N-48444, STOCK1N-63489, являющиеся аналогами известного антибиотика рифампицина. Эти молекулы продемонстрировали селективность в модели рака молочной железыы MCF10A_kat/MCF7_eGFP в диапазоне концентраций 2,5-12,5 мкг/мл. При этом, интересно, что при валидации селективности в стандартном тесте по Мосману соединения продемонстрировали селективную токсичность для клеточной линии A549’ по сравнению с VA13: STOCK1N-36111 (CC50(A549’) = 1,02±0,05 мкг/мл, CC50(VA13) = 4±1 мкг/мл); STOCK1N-48444 (CC50(A549’) = 3,0±0,4 мкг/мл, CC50(VA13) = 10±2 мкг/мл); STOCK1N-63489 (CC50(A549’) = 0,31±0,03 мкг/мл, CC50(VA13) = 1,33±0,08 мкг/мл). В отличие от препарата STOCK1N-48444, два других соединения-лидера продемонстрировали невысокий уровень токсичности для клеточной линии HEK293T: STOCK1N-36111 (CC50(HEK293T) = 4,0±0,07 мкг/мл); STOCK1N-63489 (CC50(HEK293T) = 1,70±0,08 мкг/мл). Данные значения СС50 оказались сопоставимы с уровнем соответственной токсичность на клеточной линии VA13 при том, что линия HEK293T является наиболее быстро делящейся из использованных. Основным механизмом действия для данных соединений предполагалось ингибирование ДНК-зависимуых РНК-полимеразы по аналогии с их действием в бактериях. Тем не менее, не было высокой корреляции между антибактериальным действием и действием в клетках человека серии (свыше тридцати соединений сопоставлялось) производных рифампицина, что косвенно говорит о более сложном вероятном механизме действия этих соединений. Был проведен анализ протеома клеток А549 методом двумерного гельфореза с масспектрометрическим анализом белков, уровень которых изменился после обработки одним из производных рифампицина. Оказалось, что изменился уровень нескольких белков, отвечающий за биосинтез пуринов (FDR 0.002 функциональной принадлежности по GO-анализу сервиса String). При исследовании влияния производных рифампицина в клеточной линии A549’ не было выявлено явной остановки клеточного цикла в G1 либо G2 фазе. Было показано, что под действием производных рифампицина STOCK1N-36111 и STOCK1N-48444 в клетках запускается гибель по механизму апоптоза. В целом, с учетом применения рифампицинов при микоплазменном поражении легких онкобольных было бы интересно рассмотреть эту грумму соединений как возможные бифункциональные молекулы. Во второй части проекта, посвященной исследованию лигандов GCPII наработки по зависимостям структура-активность и данные по отбору лидерных соединений послужили основой для разработки нового поколения флуоресцентно-меченных лигандов для диагностики рака простаты и будут использованы в дальнейшем для разработки адресных препаратов на основе лигандов PSMA с химиотерапевтическими молекулами. Третья часть проекта была посвящена исследованию цитотоксичности и предполагаемых механизмов действия de novo синтезированных производных классов соединений с описанным противоопухолевым потенциалом. Так, несмотря на доказанную эффективность цисплатина, ряд побочных эффектов и резистентность опухолевых клеток, накладывает ограничения на его использование в химиотерапии. Устойчивость опухолевых клеток обеспечивается экспрессией транспортеров и эффективностью механизмов репарации ДНК. Сочетание этих факторов приводит к тому, что только 1% введенного цисплатина достигает ДНК опухолевых клеток. Созданные нашими коллегами в области органической химии в ходе смежных проектов по синтезу производных цисплатина молекулы проверялись на цитотоксичность оценивали на злокачественных клеточных линиях A549 (немелкоклеточная карцинома легкого), MCF7 (рак молочной железы) и неопухолевых клеточных линиях VA13 (иммортализованные фибробласты легкого) и HEK293 (эмбриональная почка человека). Все соединения в анализе, кроме “13”, показали повышенную токсичность по сравнению с цисплатином, среди которых монокарбоксилированные соединения Pt(IV) “5”,”7” показали самую высокую токсичность на всех клеточных линиях, а также высокую эффективность в смежных тестах на устойчивой к цисплатину клеточной линии. При анализе внутриклеточного метаболизма пролекарства Pt(IV) “5” в высушенных клетках A549 с использованием метода XANES было показано, что оно быстро восстанавливается при попадании в клетку. Известно, что биотин (витамин B7) транспортируется натрий-зависимым поливитаминным транспортером (SMVT), который кодируется геном SLC5A6. Чтобы выяснить, влияет ли экспрессия SMVT на токсичность биотинсодержащих комплексов 12-14, были проведены дополнительные исследования цитотоксичности на SMVT(+) и SMVT(-) клеточных линиях, производных аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и линии эпителиальных клеток молочной железы человека MCF-10A. Экспрессию SMVT заранее подтверждали окрашиванием клеток антителами с деткцией проточной цитометрией с использованием антител Ab140974. Соединения 12-14 не показали селективности в отношении SMVT (+) опухолевых клеток MCF-7, что позволяет предположить независимый от SMVT механизм внутриклеточного накопления этих соединений. Липофильность была определена ключевой фактор эффективности препарата. Внутриклеточное накопление соединений Pt(IV) может происходить за счет активного транспорта, как предполагается для цисплатина, с помощью переносчика меди hCTR1, или за счет пассивной диффузии через бислой мембраны. Препарат должен быть наделен соответствующей липофильностью, чтобы проникать через клеточную мембрану; чрезмерно липофильное соединение будет накапливаться в мембране. Кроме того, хотя вещество Pt(IV) 14 с биотином и стеариновой кислотой в аксиальных позициях показало многообещающую антипролиферативную активность, однако в смежных тестах устойчивые к цисплатину клетки также были устойчивы к “14”. После исключения соединений “5” и “14” вещество “7” с флурбипрофеном в аксиальном положении было выбрано в качестве соединения-лидера. Ещё один заинтересовавший нас класс - 3,5-дизамещенные 1,2,4-тиадиазолов. Для них был проведен скрининг на цитотоксическое действие по отношению к клеткам аденокарциномы молочной железы MCF7 и карциномы легких А549 в описанных выше моделях флуоресцентно меченных сокультур MCF7_eGFP/MCF10A_Kat и А549’_eGFP/VA13_Kat. Было обнаружено два избирательно цитотоксичных производных: 3g проявляет пятикратную селективность цитотоксического действия к клеткам А 549 по сравнению с линией VA13, а 4g примерно в 6.4 раза более цитотоксично к гормонозависимой линии клеток MCF-7 по сравнению с MCF-10A. Таким образом, для 3,4-дихлорфенил-{3-[2-(2-морфолин-4-илэтиламино)пропил]-[1,2,4]тиадиазол-5-ил}амина и (2-{5-[(4-диэтиламинобензил)-пиридин-3-илметиламино]-[1,2,4]тиадиазол-3-ил}-1-метилвинил)-(2,2,6,6-тетраметилпиперидин-4-ил)амина продемонстрирована пяти—шестикратная селективность в парах А549/VA13 и MCF7/MCF10A соответственно. Ранее, производные гидантоина и тиогидантоина, содержащие спиро-связанные индолиноновые фрагменты, показали значительную цитотоксическую активность в экспериментах in vitro. Учитывая, что селен -содержащие соединения являются привлекательным классом соединений для поиска новых цитотоксических противоопухолевых агентов была исследована модификация спиро-связанных производных 2-галкогенимидазолона с C=Se группой {Novotortsev, 2021 #27}. Это исследование было проведено с использованием клеточных линий рака молочной железы MCF7, карциномы легкого человека A549, нераковой клеточной линии эмбриональной почки человека HEK293T и клеточной линии неопухолевых фибробластов легкого VA13. Результаты сопоставлялись с эффектами доксорубицина и цисплатина, препаратов, широко используемых в клинической практике. Данных сопоставлялись с ранее исследованными О- и S-аналогами. Наиболее цитотоксичные соединения 5b, 5c и 5e продемонстрировали цитотоксичность со значениями IC50 в диапазоне 7,6–8,7 мкМ в отношении клеточных линий A549 и MCF7, которая несколько выше чем у цисплатина против этих линий, но значительно ниже, чем цитотоксичность доксорубицина. Интересной оказалась селективность, которая наблюдалась для наиболее активных соединений среди типов клеток; таким образом, соединение 5с оказалось в семь раз более цитотоксичным по отношению к линии раковых клеток А549’ по сравнению с нераковой линией клеток VA13, что схоже с показателями для доксорубицина, у которого соотношение равнялось восьми. Сравнивая полученные данные с ранее полученными результатами для диспирогидантоинов и тиогидантоинов аналогичной структуры, можно отметить, что селенсодержащие аналоги в целом проявляли цитотоксическую активность, близкую к активности соответствующих кислород- и серо-содержащие производные. Варьирование экзоциклического кислорода или серы в имидазолоновом фрагменте диспироимидазолонов не приводило к существенному изменению цитотоксичности, но в некоторых комбинациях заместителей приводило к производным с 3-7х селективностью. Чтобы подтвердить избирательность цитотоксичности независимыми тестами и убедиться, что это не артефакт эксперимента измеряли цитотоксичность лидерных соединений с помощью анализа цитотоксичности на основе флуоресцентных клеток, а также цитотоксичность некоторых соединений с высокими, средними и нулевыми индексами селективности в МТТ-тесте путем окрашивания клеток CalceinAM. Результаты, полученные при измерении цитотоксичности альтернативными методами, в целом согласуются с результатами МТТ-теста. Синтезированные соединения также тестировали на активацию р53 в тесте активации транскрипционного репортера для выяснения их возможного механизма действия и сравнения их с ранее исследованными структурно близкими гидантоинами и тиогидантоинами. Исходили из того, что механизмы цитотоксичности исследованных соединений могут включать активацию р53. Известно, что активированный р53 индуцирует транскрипцию MDM2, который может напрямую взаимодействовать с трансактивационным доменом р53, тем самым ингибируя его транскрипционную активность, направляя его на полиубиквитинирование и дальнейшую протеасомную деградацию. Во многих линиях раковых клеток, включая MCF7 и A549, действительно наблюдается сверхэкспрессия MDM2, приводящая к значительному ослаблению апоптоза. Контрольное соединение Nutlin-3a вызывает прямую активацию р53 через блокирование взаимодействий р53-MDM2 и повышает активность р53 до 5-10 раз в репортерном анализе. Для исследованных Se-спирооксиндолов только для соединения 6l в высокой концентрации (>100 мкМ) обработка клеток приводила к двукратной активации р53; эта активация была существенно меньше, чем у Nutlin-3a, но сравнима с опосредованным действием цисплатина, что позволяет предположить, что исследуемые соединения могут иметь только опосредованный р53-зависимый механизм действия. Следовательно, несмотря на умеренную цитотоксичность некоторых исследованных селенимидазолонов и полученные ранее данные моделирования (докинга в MDM2), их основное токсическое действие на клетку не было обусловлено прямой активацией белка р53. Заключеник Было отобрано несколько соединений, обладающих селективностью действия в клеточных моделях. Для лидерных препаратов были исследованы влияние на клеточный цикл, проведен анализ изменений протеома, проанализированы основные механизмы клеточной гибели. Была проверена гипотеза, что ингибиторы GCPII могут ингибировать модели сосудообразования in vitro. Было достигнуто ингибирование препаратами образование сосудоподобной сети клетками HUVEC, тем не менее концентрации препаратов, требуемые для этого и наши знания об эффективности ингибиторов GCPII не позволяют говорить о специфичности эффектов. Для поиска избирательно действующих на опухолевые клетки препаратов исследована цитотоксичность и некоторые предполагаемые механизмы действия ряда групп веществ, синтезированных по структурной аналогии с уже известными действующими соединениям в рамках смежных проектов по органическому синтезу. При поддержке проекта опубликовано десять статей и оформлена патентная заявка на новых класс препаратов, обладающих противоопухолевым потенциалом

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".