ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Проект направлен на разработку принципиально новой сенсорной системы молекулярного узнавания определенных последовательностей нуклеиновых кислот на примере обнаружения мутаций в промоторе гена каталитической субъединицы теломеразы человека. Обнаружение мутаций в промоторе гена каталитической субъединицы теломеразы человека в моче рассматривается в качестве основы неинвазивной диагностики рака мочевого пузыря. В данном проекте будут исследованы возможности спектроскопии поверхностного усиленного (резонансного) комбинационного рассеяния [англ. surface-enhanced (resonance) Raman scattering, SERS (SERRS)] – [русск. гигантского (резонансного) комбинационного рассеяния] – ГКР (ГРКР) за счет структурирования поверхности наночастиц самособирающимися структурами на основе ДНК для обнаружения определенных последовательностей нуклеиновых кислот и определении малых количеств нуклеиновых кислот. Предполагается, что метод будет сопоставимым по чувствительности с ПЦР без ограничений, налагаемых необходимостью амплификации и присутствием ингибиторов в образце. Планируется оценка влияния природы узнавания последовательности на основе Уотсон-Криковских и неканонических взаимодействий на ГКР-сенсорную систему. Планируется апробация предложенного подхода для обнаружения ДНК в модельных образцах и биоматериале.
The project is aimed at the development of a fundamentally new sensor system of molecular recognition of certain nucleic acid sequences on the example of mutation in the promoter of human telomerase catalytic subunit gene. Detection of mutations in the promoter of the human telomerase catalytic subunit gene in biological fluids is the basis for noninvasive diagnosis of bladder cancer. This project will investigate the possibilities of spectroscopy of surface enhanced (resonance) Raman scattering (SERRS) by structuring the surface of nanoparticles self-assembling structures based on DNA to detect certain sequences of nucleic acids and determining small quantities of nucleic acids. It is assumed that the method will be comparable in sensitivity to PCR without restrictions imposed using enzymes and the presence of inhibitors in the sample. It is planned to assess the impact of the nature of sequence recognition based on Watson-Crick and non-canonical interactions on the SERS-sensor system. It is planned to test the proposed approach for DNA detection in model samples and biomaterials.
В результате выполнения проекта будут получены данные, позволяющие подтвердить гипотезу, что изменение поверхности серебра с помощью модификации химически-модифицированными олигонуклеотидами в сочетании со структурированием поверхности на основе самосборки ДНК-структур различной природы позволит получить сенсорную систему узнавания специфических последовательностей нуклеиновых кислот в субпикомолярных концентрациях без использования ферментативной амплификации взаимодействий в присутствии компонентов биологических жидкостей. Будет проверено влияние на сигнал гигантского (поверхностно усиленного) комбинационного рассеяния (ГКР) ДНК-сформированной поверхности на основе узнавания специфической последовательности как за счет Уотсон-Криковских взаимодействий, так и за счет образования неканонических структур в условиях одной системы. Проверка основной идеи проекта – узнавания нуклеиновых кислот за счет ДНК-инициированной перестройки поверхности будет проходить на системе, которая позволит понять различия использования канонических и неканонических взаимодействий в идентификации нуклеиновых кислот с использованием спектроскопии ГКР. При правильности гипотезы проекта, полученная система может быть в дальнейшем использована для разработки метода неинвазивной диагностики рака мочевого пузыря на основе прямого обнаружения опухолевой ДНК в моче. Фундаментальное развитие метода позволит проводить анализ по присутствию малых количеств специфической последовательности внеклеточной нуклеиновой кислоты в биологических жидкостях на прямую, без сложной пробоподготовки. В результате первого года выполнения проекта будет сконструированы, синтезированы химически модифицированные олигонуклеотиды, несущие ГКР-индикаторы, модифицированые поверхности для ГКР-обнаружения, а также протестированы системы узнавания нуклеиновых кислот, основанные на принципе узнавания канонических и неканонических взаимодействий (проверка различных сенсорных олигонуклеотидов: 1) неструктурированных, узнающих мишень за счет образования классического дуплекса, 2) образующих шпильку и узнающих мишень за счет образования классического дуплекса на основе раскрытия шпильки, 3) формирующих квадруплекс с мишенью), позволяющие обнаруживать мутации C228T и/или C250T в последовательности промотора гена теломеразной каталитической субъединицы TERT человека. Результаты мультиплексного обнаружения мутаций C228T и C250T в последовательности промотора гена теломеразной каталитической субъединицы TERT человека позволят проверить возможность мультиплицирования измерений в проверяемой технологической системе. В первый год планируется получение специфического сигнала системы от присутствия мишени в форме пиков с характеристическими частотами (КР-сдвигами) при сравнительном анализе спектров ГКР. Это позволит сделать вывод о наличие сигнала, специфически зависящего от присутствия последовательности ДНК-мишени, несущей мутации по сравнению с последовательностью дикого типа. При дальнейшем выполнении проекта во второй и третий годы будет проведен анализ общих закономерностей применимости модификации ГКР-подхода для идентификации нуклеиновых кислот. Будут получены количественные зависимости сигнала ГКР-сенсорной системы от мишени и охарактеризована чувствительность разработанного подхода. Будет проведено сравнение эффективности разработанного метода по чувствительности, специфичности и ошибке для системы определения мутации C228T или C250T в последовательности промотора гена теломеразной каталитической субъединицы TERT при определении этих последовательностей с наиболее современным методом определения специфической последовательности нуклеиновых кислот, разработанным на основе количественной капельной ПЦР (ddPCR). Сравнение будет проведено на искусственно полученных контрольных образцах ДНК, содержащих различное соотношение последовательностей, несущих мутации и нет. Будет проверена возможность мультиплицирования измерения на основе одновременного обнаружения мутаций C228T и C250T в последовательности промотора гена теломеразной каталитической субъединицы TERT. При достижении поставленной цели проекта будет проведено измерение присутствия мутаций C228T и/или C250T в последовательности промотора гена теломеразной каталитической субъединицы TERT в клинических образцах мочи здоровых людей и людей с онкологическими заболеваниями мочевого пузыря в сравнении с ddPCR-анализом ДНК, выделенной из мочи. Будет проведено прямое определение внеклеточной опухолевой ДНК в моче с использованием системы на основе спектроскопии ГКР.
Коллектив проекта состоит из исполнителей, имеющих необходимый опыт для выполнения такого междисциплинарного проекта. Так, руководитель проекта – доцент кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ, к.х.н. Зверева Мария Эмильевна имеет опыт исследований теломеразы. Доцент кафедры аналитической химии Химического факультета МГУ, к.х.н. Веселова Ирина Анатольевна имеет опыт разработки приложений на основе спектроскопии гигантского (поверхностно усиленного) комбинационного рассеяния (ГКР) в приложении к определению низкомолекулярных соединений на основе их взаимодействия с поверхностью, подтвержденный публикациями. Для реализации эффекта ГКР и перехода к резонансному варианту спектроскопии ГКР (ГРКР) существуют технический задел в виде подготовки поверхностей на основе серебра, изучение эффекта усиления сигналов ГКР и технические возможности (КР-спектрометер Renishaw InVia Reflex с аргоновым, диодным и твердотельным источниками, оснащенный термоаналитическим столиком металлографический микроскоп Eclipse 600pol (Nikon) с термостоликом; спектрофотометр Shimadzu; спектрофлуориметр Agilent ExVarian; ИК-спектрометр с Фурье-преобразованием) . У сотрудника. У Валентины Фарзан есть опыт синтеза химически модифицированных олигонуклеотидов, содержащих флуоресцентные красители и другие функциональные низкомолекулярные соединения, в том числе остатки родамина 6Ж и вся необходимая приборная база для такого синтеза (ДНК/РНК синтезатор Mermade MM-12; Жидкостной хроматограф Dionex Ultimate 3000 с функцией автоматического сбора фракций для очистки РНК методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации; Agilent 1260 для характеристики РНК методом обращенно-фазовой хроматографии; хроматомасс-спектрометр Dionex Ultimate 3000/ Thermo LCQ в СколТех), а также техническая возможность сравнения на системе QX200, Bio-Rad для ddPCR, состоящая из генетатора, ПЦР-амплификатора и ридера.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 31 августа 2018 г.-31 августа 2019 г. | Селективная система молекулярного узнавания фрагментов ДНК конъюгатами олигонуклеотидов с наночастицами серебра и/или золота для определения мутаций методом гигантского комбинационного рассеяния |
Результаты этапа: Глобальной задачей проекта является понимание принципов и разработка на их основе системы узнавания фрагментов ДНК конъюгатами олигонуклеотидов с наночастицами металлов для обнаружения и определения заданной ДНК с последовательностью промотора гена каталитической субъединицы теломеразы (TERT) человека (с мутациями и дикого типа) с высокими чувствительностью, селективностью (различие между последовательностью ДНК с мутацией и дикого типа) и быстротой для создания инновационного метода диагностики онкологических заболеваний при содержании фрагментированных молекул геномной ДНК с соматическими мутациями в образце с низкими концентрациями (менее 1·10–11 М). Для этого в качестве метода определения была выбрана спектроскопия поверхностного усиленного (резонансного) гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) с усилением сигнала от малых количеств последовательности TERT-промотора за счет структурирования поверхности наночастиц с использованием ДНК и ГКР-активной модификации нуклеиновых кислот. Основной целью первого этапа проекта было показать принципиальную возможность разработки метода детекции таких малых количеств ДНК без предварительной ПЦР-амплификации, доказать работоспособность концепции. При проведении на первом этапе расчетов и планирования необходимых последовательностей самособирающихся ДНК-структур различной геометрии для модификации поверхности и сенсорных ДНК-последовательностей оказалось, что фундаментальных правил, определяющих оптимальное расстояние ГКР-активной метки от поверхности для нуклеиновых кислот, не известно. Есть данные по покрытию частиц различными полимерами не нуклеиновой природы слоем с различной толщиной, разделяющим поверхность с наночастицами и ГКР-активное соединение (R6G). Ширина такого слоя для усиления сигнала составила около 5 нм (G. Kumari, J. Kandula, Ch. Narayana. How Far Can We Probe by SERS? J. Phys. Chem. 2015, 119 (34), 20057-20064). Поэтому встал вопрос, что для расчета самособирающихся структур ДНК, меняющих свою конформацию в присутствии аналитической ДНК-последовательности, независимо от того по какому принципу идет узнавание мишени (за счет образования классического дуплекса, за счет образования дуплекса на основе раскрытия исходной шпильки или формирующих квадруплекс с мишенью) необходимо понимание, где именно по отношению к поверхности должна находится ГКР-активная модификация олигонуклеотида для максимального усиления сигнала. Также было принято во внимание пожелание рецензента о снижении рискованности проекта и доказательстве принципиальной работоспособности метода (возможность получения усиления сигнала, сопоставимого с ПЦР-амплификацией). Поэтому, во-первых, нужно было создать систему олигонуклеотидов, которая позволила бы нам доказать возможность реализации концепции проекта и определить правила построения системы для получения максимального усиления в случае использования нуклеиновых кислот для структурирования поверхности и ГКР-активной модификации олигонуклеотидов. Мы разработали модельную систему олигонуклеотидов на основе последовательности промотора гена теломеразной каталитической субъединицы, которая однозначно показала бы возможность поверхностного усиления сигнала (рисунок 1 файла «приложение к отчету») и за счет перехода конформаций ДНК “клубок” - ”стержень” при переходе от одноцепочечной ДНК к двойной спирали позволила поместить ГКР-активную модификацию олигонуклеотида в разное положение относительно поверхности, моделируя увеличение расстояния (рисунок 2 файла «приложение к отчету»). Мы выбрали для модификации олигонуклеотидов два ГКР-активных соединения для понимания общей закономерности: 1) родамин 6Ж, (E)-2-(6-(этиламино)-3-(этилимино))-2,7-диметил-8а,10а-дигидро-3Н-ксантен-9-ил)бензоат (R6G) как наиболее изученное и заявленное в плане работ; 2) (2-((E)-3-((Z)-1-(5-)карбоксипентил)-3,3-диметилиндолин-2-илиден) проп-1-ен-1-ил]-1,3,3-триметил-3Н-индол-1-им (Cy3) как менее охарактеризованное ГКР-активное соединение, часто используемое при синтезе модифицированных нуклеиновых кислот. Кроме того, коммерчески доступные He-Ne и Ar+ лазеры, используемые в ГКР-спектроскопии, имеют длины волн в видимом диапазоне: 514.5 и 633 нм соответственно, а для усиления сигнала необходимо совпадение диапазона поглощения анализируемого вещества и длины волны лазера. Модифицированные выбраными красителями олигонуклеотиды имеют соответствующие диапазоны поглощения: R6G (max 524 нм) и Cy3 (max 550 nm). Мы синтезировали разработанными ранее методами модифицированные олигонуклеотиды, где Cy3 и R6G, связанны с 5'-концом олигонуклеотидов (структурные формулы представлены на схеме 1 в файле «приложение к отчету»). Для закрепления олигонуклеотидов на поверхности наночастиц и одновременного усиления сигнала мы использовали открытые недавно определенные последовательности нуклеиновых кислот (мы назвали их «якорные» последовательности), которые позволяют специфически взаимодействовать в растворе с наночастицами (или кластерами наночастиц) серебра определенного размера (L. Ge, X. SunQing, H. Li. Ratiometric Catalyzed-Assembly of NanoCluster Beacons: A Nonenzymatic Approach for Amplified DNA Detection. ACS Appl Mater Interfaces. 2017, 9(37): 32089-32096) и может быть использовано для создания детектирующих систем (M. Liang, J. Sun, X. Liu, F. Wang. Lighting Up Fluorescent Silver Clusters via Target-Catalyzed Hairpin Assembly for Amplified Biosensing. Langmuir. 2018, 34(49): 14851-14857). Так авторами было показано, что дающие зеленую окраску НЧС при взаимодействии со специфической ДНК (последовательность GnuS) эффективно трансформируются в дающие красную при размещении за счет взаимодействия с аналитом в непосредственной близости от другого специального фрагмента ДНК (последовательность RnuS). Классическим способом закрепления нуклеиновых кислот на поверхности серебра является тиолирование (именно эта модификация исходно планировалась для иммобилизации олигонуклеотидов и в этом случае необходимо было синтезировать нуклеиновые кислоты, несущие как ГКР-активную модификацию, так и тиоловую группу). Особенностью использования тиолированных олигонуклеотидов для закрепления на поверхности серебра является статистическое распределение количества олигонуклеотидов на одну наночастицу/кластер при модификации. Это вносит неупорядоченность в структурирование поверхности наночастиц, в то время как для усиления сигнала необходима максимальная гомогенность структурирования сенсорной поверхности (McNay G. et al. (2011). Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) and Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering (SERRS): A Review of Applications. Applied Spectroscopy, 65(8): 825–837). При создании системы олигонуклеотидов для экспериментов “proof-of-concept” нами были выбраны именно “якорные” последовательности из работы (ACS Appl Mater Interfaces 2017, 9(37): 32089-32096), которые могут обеспечить соотношение 1:1 между наночастицей (или кластером наночастиц) и иммобилизованным нуклеотидом с дополнительным усилением сигнала. Для этого были использованы две последовательности GnuS и RnuS (таблица 1 последовательностей олигонуклеотидов в дополнительном файле «приложение к отчету»). В качестве металлических наночастиц на начальном этапе проекта были выбраны наночастицы серебра (НЧС) как наиболее хорошо изученные для создания систем детекции веществ с помощью спектроскопии поверхностного усиленного (резонансного) гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) и взаимодействующие с «якорными» последовательностями ДНК. Было проверено два пути: структурирование НЧС олигонуклеотидами в растворе до нанесения на поверхность и получение поверхности с распределением НЧС с последующим взаимодействием с олигонуклеотидами. В первом случае в качестве металлических наночастиц использовали частицы серебра диаметром 25 и 35 нм с достаточно монодисперсным распределением по размерам, которые обладали максимумами поглощения при 408 и 418 нм с шириной пика на полувысоте ~ 80 и 100 нм. Далее добавляли олигонуклеотиды, содержащие последовательности GnuS и RnuS, в том числе ковалентно модифицированные ГКР-активными соединениями. Последовательности олигонуклеотидов приведены в таблице файла «приложение к отчету». После проведения реакций полученных золей серебра с ГКР-меченными олигонуклеотидными GnuS и RnuS, отличающимися по длине и способности взаимодействовать с наночастицами\кластерами наночастиц серебра, изменение полосы поглощения раствора не наблюдали по сравнению с исходным раствором. Этот факт свидетельствовал о неэффективности использования коллоидных растворов наночастиц размерами менее 50 нм. Взаимодействие с олигонуклеотидными GnuS и RnuS с наночастицами\кластерами наночастиц серебра описано, но недостаточно изучено. Точный размер наночастиц или их кластеризация необходимые для эффективного взаимодействия недостаточно охарактеризованы, поэтому перешли к альтернативному методу получения наночастиц на поверхности и их последующей модификации нуклеиновыми кислотами. Для достижения высокой чувствительности далее использовали наноструктурированные серебряные поверхности, полученные химическим способом – путем пиролизного разложения аэрозоля водного аммиачного комплекса оксида серебра(I) – на стеклянной пластинке в мягких условиях без дополнительных стабилизирующих агентов. Для этого была собрана установка, позволяющая провести получение такого материала (фотография файла «установка»). Термическое восстановление серебра(I) ультразвуковым серебряным дождем проводили на предварительно нагретых до 280 – 300°С тонких стеклянных пластинках (толщиной 2 мм) для получения наноструктурированных покрытий из серебра. При этом каждая капля аэрозоля (диаметром 1 – 5 мкм) служила “микрореактором”, подвергаясь тепловому шоку, что обеспечивало структуру перекрывающихся «кофейных» колец (наблюдаемых в оптическом микроскопе и диаметром 30 – 50 мкм), состоящих из кластеров НЧС различного размера в диапазоне 50 – 90 нм. Наноструктурированные серебряные покрытия были охарактеризованы различными физико-химическими методами. Таким образом, в результате выполнения работ по настоящему проекту: 1. Получены наноструктурированные серебряные покрытия. Оптимизированные ГКР-активные поверхности имели шероховатую микроструктуру с агрегатами наночастиц серебра (50 – 90 нм) в виде зерен. Расстояние между наночастицами серебра составляло 30 – 70 нм. Все наночастицы различного размера располагались на этих покрытиях в виде пористых слоев. 2. Морфологию (размер, форму и распределение НЧС по поверхности ГКР-сенсора) разработанных поверхностей характеризовали и подтверждали методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и спектроскопии зеркального отражения (наблюдали широкую полосу поверхностного плазмонного резонанса для полученных НЧС: 450 – 700 нм). 3. Дополнительной модификации поверхности наночастиц серебра слоями оптически прозрачных полимеров (полиэлектролитов) различной природы для регистрации усиленного сигнала не потребовалось. 4. Проверку возможности регистрации усиленных характеристических спектров ГКР для модельных красителей на получаемых наноструктурах проводили на примере родамина 6Ж и цианинового красителя (Cy3). Рассчитанные из экспериментальных данных аналитические коэффициенты усиления (КУ) составили 5 – 6 порядков. 5. Используемая в экспериментах квадратная форма ГКР-сенсорного элемента (4х4 мм2) удобна и адаптирована для применения в работе с коммерчески доступными серийными КР-спектрометрами, в т.ч. портативными. Мы проверили и показали наличие специфического сигнала ГКР в присутствии ГКР-меченной мишени (схема эксперимента представлена на рисуноке 1 файла «приложение к отчету»), что позволило нам сделать вывод о специфической иммобилизации олигонуклеотидов на полученной нами поверхности с помощью “якорных последовательностей”. Проверено, что без ГКР-меченной мишени нужные нам сигналы отсутствуют. При использовании олигонуклеотидов, которые позволяют получить дуплексы различной длины (рисунок 2 файла «приложение к отчету»), мы показали, что усиление сигнала зависит от расстояния и природы ГКР-модификации нуклеиновых кислот (эти результаты описаны в статье по проекту Olga E. Eremina, Timofei S. Zatsepin, Valentina M. Farzan, Irina A. Veselova, Maria I. Zvereva, DNA detection with dye-labeled oligonucleotides by surface enhanced Raman spectroscopy, Mendeleev Comm., 2019, направлена в редакцию). Техническим результатом работы является формулирование правил: 1) как селективно связывать и равномерно структурировать анализируемое вещество по поверхности ГКР-сенсорного устройства, что подтверждается регистрацией идентичных по интенсивности аналитических сигналов по всей площади поверхности наноструктур (n = 10; P = 0.95); 2) как контролировать расположение ГКР-метки относительно поверхности наноструктур серебра, что подтверждается регистрацией различных по усилению аналитических концентраций для идентичных концентраций ДНК с различным расположением ГКР-метки. Эти правила позволяют детектировать ДНК с низкими пределами обнаружения методом спектроскопии ГКР (подана заявка на патент). В дальнейшем предполагается использовать систему, в которой ГКР-меченный олигонуклеотид присоединяется только после индуцируемой определенной последовательностью ДНК (аналитом) перестройки структуры олигонуклеотида, закрепленного на поверхности. Заявленный в заявке на патент оптический сенсор позволяет регистрировать усиленный и воспроизводимый сигнал комбинационного рассеяния, интенсивность которого зависит от концентрации ДНК-мишени. Предложенный нами метод включает в себя приготовление планарной ГКР-активной поверхности из наночастиц благородных металлов (на первом этапе наш выбор остановился на наночастицах серебра как наиболее изученных в ГКР-системах усиления); последующую гибридизацию фрагмента ДНК с различными комплементарными олигонуклеотидами, ковалентно модифицированных ГКР-метками и олигонуклеотидом, иммобилизованным на поверхности; добавления капли раствора образца на поверхность, покрытую наночастицами, направленное структурирование определяемых соединений (нуклеиновых кислот) на ГКР-сенсорной поверхности за счет нековалентных взаимодействий; облучения монохроматическим пучком лазера и определение фрагментов ДНК в изучаемом образце методом спектроскопии ГКР на основе интенсивности сигналов на регистрируемых спектрах. На основе полученных данных о необходимом расстоянии между поверхностью и ГКР-меткой в олигонуклеотиде, были выбраны 2 набора олигонуклеотидов (таблица 1 приложения к отчету), которые позволят дискриминировать последовательности TERT промотора дикого типа и несущие мутации C228T и С250T в двух вариантах для R6G- и Сy3- модификации. Так как усиление сигнала в случае R6G происходит при уменьшении расстояния от R6G до поверхности, то выбран вариант раскрытия шпильки (олигонуклеотиды GnuS-C250T-R6G и GnuS-С228Т-R6G) в присутствии аналитических последовательностей (модельные олиги-аналиты: А-С250T, А-C228T, А-Wt). В случае с Cy3-модификации последовательность “якоря” соединена с последовательностью промотера TERT с двумя мутациями (GnuS-pr-2 mt) и с единичными (GnuS-pr-C250T, GnuS-pr-С228Т) и добавленной искусственно последовательностью шпильки, происходит аналогичная перестройка в присутствии аналитов с образованием длинного дуплекса и раскрытием добавленной искусственно последовательностью шпильки, так что появляется свободный одноцепочечный конец. В этом случае становится возможным присоединение на этот конец Cy3-меченного тестового олигонуклеотида (Су3-test) c образование дополнительной двойной спирали. Таким образом “заякоривание” на поверхности Cy3-меченного тестового олигонуклеотида становится возможным только в присутствии аналита в системе. Этот вариант предпочтительнее, так как происходит появление детектируемого сигнала, так как по данным первого года нанесение меченного олигонуклеотида без якорной последовательности не дает детектируемых сигналов. Оба подхода планируется проверить при продолжении проекта. | ||
2 | 1 сентября 2019 г.-31 августа 2020 г. | Селективная система молекулярного узнавания фрагментов ДНК конъюгатами олигонуклеотидов с наночастицами серебра и/или золота для определения мутаций методом гигантского комбинационного рассеяния |
Результаты этапа: Проект направлен на разработку принципов обнаружения фрагментов ДНК с определенной первичной структурой конъюгатами олигонуклеотидов с наночастицами металлов методом спектроскопии поверхностного усиленного (резонансного) гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) и их использование для создания селективной системы узнавания ДНК-аналита. В проекте в качестве ДНК-аналита выбран участок промотора гена каталитической субъединицы теломеразы (TERT) человека (с мутациями C228Т или С250Т и без). Такой выбор был обусловлен возможностью создания инновационного метода неинвазивной диагностики рака мочевого пузыря по результатам выполнения проекта. Обоснование такой возможности было представлено в обзоре Zvereva et al., Int. J. Mol. Sci. 2020. Основной целью второго этапа проекта было реализовать референсный разрабатываемому метод -цифровую капельную ПЦР (статья направлена в редакцию), чтобы показать возможность детекции определенной последовательности ДНК-аналита без предварительной ПЦР-амплификации (подана заявка на патент), что покажет работоспособность концепции проекта. Для сравнения способа закрепления на наноструктурированной поверхности серебра с помощью кластер-узнающих последовательностей был проверен синтез тиолированных олигонуклеотидов со сходной первичной структурой и проведен классический способ закрепления последовательности ДНК-олигонуклеотидов на поверхности серебра, который показал сравнимые результаты. Показано преимущество зондов с двумя способами иммобилизации на поверхности и фиксации структуры (одновременное наличие SH-группы и аптамерной последовательности к наночастицам серебра) перед зондами с одним любым типом иммобилизации. | ||
3 | 4 марта 2021 г.-1 марта 2022 г. | Селективная система молекулярного узнавания фрагментов ДНК конъюгатами олигонуклеотидов с наночастицами серебра и/или золота для определения мутаций методом гигантского комбинационного рассеяния |
Результаты этапа: Проанализированы образцы внеклеточных ДНК (из мочи) на присутствие мутаций в промоутерной области гена TERT с помощью числовой капельной ПЦР с синтетической системой контроля(см. 2й этап). Опубликована статья "Urine TERT promoter mutations‑based tumor DNA detection in patients with bladder cancer: A pilot study" Авторы: Mark Jain, David Kamalov, Alexander Tivtikyan, Alexander Balatsky, Larisa Samokhodskaya, Dmitry Okhobotov, Polina Kozlova, Eduard Pisarev, Maria Zvereva, Armais Kamalov в журнале Molecular and Clinical Oncology, издательство Spandidos Publications UK (London, UK), том 15, № 6 DOI. Проанализированы подложки разного типа для анализа ДНК без амплификации. Опубликован обзор "Amplification-Free Identification and Determination of Nucleic Acids by Surface Plasmon Resonance and Surface-Enhanced Raman Spectroscopy" Авторы Pisarev E.K., Kapitanova O.O., Vesolova I.A., Zvereva M.I. в журнале Moscow University Chemistry Bulletin, издательство Allerton Press Inc. (United States), том 76, № 6, с. 353-360 DOI. Протестированы новые типы подложек экспериментально и проверено влияние мочевины (модель мочи) |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".