Селективная система молекулярного узнавания фрагментов ДНК конъюгатами олигонуклеотидов с наночастицами серебра и/или золота для определения мутаций методом гигантского комбинационного рассеянияНИР

System of selective molecular recognition of DNA fragments by oligonucleotides- conjugates with silver and/or gold nanoparticles for the determination of mutations by Raman scattering

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 31 августа 2018 г.-31 августа 2019 г. Селективная система молекулярного узнавания фрагментов ДНК конъюгатами олигонуклеотидов с наночастицами серебра и/или золота для определения мутаций методом гигантского комбинационного рассеяния
Результаты этапа: Глобальной задачей проекта является понимание принципов и разработка на их основе системы узнавания фрагментов ДНК конъюгатами олигонуклеотидов с наночастицами металлов для обнаружения и определения заданной ДНК с последовательностью промотора гена каталитической субъединицы теломеразы (TERT) человека (с мутациями и дикого типа) с высокими чувствительностью, селективностью (различие между последовательностью ДНК с мутацией и дикого типа) и быстротой для создания инновационного метода диагностики онкологических заболеваний при содержании фрагментированных молекул геномной ДНК с соматическими мутациями в образце с низкими концентрациями (менее 1·10–11 М). Для этого в качестве метода определения была выбрана спектроскопия поверхностного усиленного (резонансного) гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) с усилением сигнала от малых количеств последовательности TERT-промотора за счет структурирования поверхности наночастиц с использованием ДНК и ГКР-активной модификации нуклеиновых кислот. Основной целью первого этапа проекта было показать принципиальную возможность разработки метода детекции таких малых количеств ДНК без предварительной ПЦР-амплификации, доказать работоспособность концепции. При проведении на первом этапе расчетов и планирования необходимых последовательностей самособирающихся ДНК-структур различной геометрии для модификации поверхности и сенсорных ДНК-последовательностей оказалось, что фундаментальных правил, определяющих оптимальное расстояние ГКР-активной метки от поверхности для нуклеиновых кислот, не известно. Есть данные по покрытию частиц различными полимерами не нуклеиновой природы слоем с различной толщиной, разделяющим поверхность с наночастицами и ГКР-активное соединение (R6G). Ширина такого слоя для усиления сигнала составила около 5 нм (G. Kumari, J. Kandula, Ch. Narayana. How Far Can We Probe by SERS? J. Phys. Chem. 2015, 119 (34), 20057-20064). Поэтому встал вопрос, что для расчета самособирающихся структур ДНК, меняющих свою конформацию в присутствии аналитической ДНК-последовательности, независимо от того по какому принципу идет узнавание мишени (за счет образования классического дуплекса, за счет образования дуплекса на основе раскрытия исходной шпильки или формирующих квадруплекс с мишенью) необходимо понимание, где именно по отношению к поверхности должна находится ГКР-активная модификация олигонуклеотида для максимального усиления сигнала. Также было принято во внимание пожелание рецензента о снижении рискованности проекта и доказательстве принципиальной работоспособности метода (возможность получения усиления сигнала, сопоставимого с ПЦР-амплификацией). Поэтому, во-первых, нужно было создать систему олигонуклеотидов, которая позволила бы нам доказать возможность реализации концепции проекта и определить правила построения системы для получения максимального усиления в случае использования нуклеиновых кислот для структурирования поверхности и ГКР-активной модификации олигонуклеотидов. Мы разработали модельную систему олигонуклеотидов на основе последовательности промотора гена теломеразной каталитической субъединицы, которая однозначно показала бы возможность поверхностного усиления сигнала (рисунок 1 файла «приложение к отчету») и за счет перехода конформаций ДНК “клубок” - ”стержень” при переходе от одноцепочечной ДНК к двойной спирали позволила поместить ГКР-активную модификацию олигонуклеотида в разное положение относительно поверхности, моделируя увеличение расстояния (рисунок 2 файла «приложение к отчету»). Мы выбрали для модификации олигонуклеотидов два ГКР-активных соединения для понимания общей закономерности: 1) родамин 6Ж, (E)-2-(6-(этиламино)-3-(этилимино))-2,7-диметил-8а,10а-дигидро-3Н-ксантен-9-ил)бензоат (R6G) как наиболее изученное и заявленное в плане работ; 2) (2-((E)-3-((Z)-1-(5-)карбоксипентил)-3,3-диметилиндолин-2-илиден) проп-1-ен-1-ил]-1,3,3-триметил-3Н-индол-1-им (Cy3) как менее охарактеризованное ГКР-активное соединение, часто используемое при синтезе модифицированных нуклеиновых кислот. Кроме того, коммерчески доступные He-Ne и Ar+ лазеры, используемые в ГКР-спектроскопии, имеют длины волн в видимом диапазоне: 514.5 и 633 нм соответственно, а для усиления сигнала необходимо совпадение диапазона поглощения анализируемого вещества и длины волны лазера. Модифицированные выбраными красителями олигонуклеотиды имеют соответствующие диапазоны поглощения: R6G (max 524 нм) и Cy3 (max 550 nm). Мы синтезировали разработанными ранее методами модифицированные олигонуклеотиды, где Cy3 и R6G, связанны с 5'-концом олигонуклеотидов (структурные формулы представлены на схеме 1 в файле «приложение к отчету»). Для закрепления олигонуклеотидов на поверхности наночастиц и одновременного усиления сигнала мы использовали открытые недавно определенные последовательности нуклеиновых кислот (мы назвали их «якорные» последовательности), которые позволяют специфически взаимодействовать в растворе с наночастицами (или кластерами наночастиц) серебра определенного размера (L. Ge, X. SunQing, H. Li. Ratiometric Catalyzed-Assembly of NanoCluster Beacons: A Nonenzymatic Approach for Amplified DNA Detection. ACS Appl Mater Interfaces. 2017, 9(37): 32089-32096) и может быть использовано для создания детектирующих систем (M. Liang, J. Sun, X. Liu, F. Wang. Lighting Up Fluorescent Silver Clusters via Target-Catalyzed Hairpin Assembly for Amplified Biosensing. Langmuir. 2018, 34(49): 14851-14857). Так авторами было показано, что дающие зеленую окраску НЧС при взаимодействии со специфической ДНК (последовательность GnuS) эффективно трансформируются в дающие красную при размещении за счет взаимодействия с аналитом в непосредственной близости от другого специального фрагмента ДНК (последовательность RnuS). Классическим способом закрепления нуклеиновых кислот на поверхности серебра является тиолирование (именно эта модификация исходно планировалась для иммобилизации олигонуклеотидов и в этом случае необходимо было синтезировать нуклеиновые кислоты, несущие как ГКР-активную модификацию, так и тиоловую группу). Особенностью использования тиолированных олигонуклеотидов для закрепления на поверхности серебра является статистическое распределение количества олигонуклеотидов на одну наночастицу/кластер при модификации. Это вносит неупорядоченность в структурирование поверхности наночастиц, в то время как для усиления сигнала необходима максимальная гомогенность структурирования сенсорной поверхности (McNay G. et al. (2011). Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) and Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering (SERRS): A Review of Applications. Applied Spectroscopy, 65(8): 825–837). При создании системы олигонуклеотидов для экспериментов “proof-of-concept” нами были выбраны именно “якорные” последовательности из работы (ACS Appl Mater Interfaces 2017, 9(37): 32089-32096), которые могут обеспечить соотношение 1:1 между наночастицей (или кластером наночастиц) и иммобилизованным нуклеотидом с дополнительным усилением сигнала. Для этого были использованы две последовательности GnuS и RnuS (таблица 1 последовательностей олигонуклеотидов в дополнительном файле «приложение к отчету»). В качестве металлических наночастиц на начальном этапе проекта были выбраны наночастицы серебра (НЧС) как наиболее хорошо изученные для создания систем детекции веществ с помощью спектроскопии поверхностного усиленного (резонансного) гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) и взаимодействующие с «якорными» последовательностями ДНК. Было проверено два пути: структурирование НЧС олигонуклеотидами в растворе до нанесения на поверхность и получение поверхности с распределением НЧС с последующим взаимодействием с олигонуклеотидами. В первом случае в качестве металлических наночастиц использовали частицы серебра диаметром 25 и 35 нм с достаточно монодисперсным распределением по размерам, которые обладали максимумами поглощения при 408 и 418 нм с шириной пика на полувысоте ~ 80 и 100 нм. Далее добавляли олигонуклеотиды, содержащие последовательности GnuS и RnuS, в том числе ковалентно модифицированные ГКР-активными соединениями. Последовательности олигонуклеотидов приведены в таблице файла «приложение к отчету». После проведения реакций полученных золей серебра с ГКР-меченными олигонуклеотидными GnuS и RnuS, отличающимися по длине и способности взаимодействовать с наночастицами\кластерами наночастиц серебра, изменение полосы поглощения раствора не наблюдали по сравнению с исходным раствором. Этот факт свидетельствовал о неэффективности использования коллоидных растворов наночастиц размерами менее 50 нм. Взаимодействие с олигонуклеотидными GnuS и RnuS с наночастицами\кластерами наночастиц серебра описано, но недостаточно изучено. Точный размер наночастиц или их кластеризация необходимые для эффективного взаимодействия недостаточно охарактеризованы, поэтому перешли к альтернативному методу получения наночастиц на поверхности и их последующей модификации нуклеиновыми кислотами. Для достижения высокой чувствительности далее использовали наноструктурированные серебряные поверхности, полученные химическим способом – путем пиролизного разложения аэрозоля водного аммиачного комплекса оксида серебра(I) – на стеклянной пластинке в мягких условиях без дополнительных стабилизирующих агентов. Для этого была собрана установка, позволяющая провести получение такого материала (фотография файла «установка»). Термическое восстановление серебра(I) ультразвуковым серебряным дождем проводили на предварительно нагретых до 280 – 300°С тонких стеклянных пластинках (толщиной 2 мм) для получения наноструктурированных покрытий из серебра. При этом каждая капля аэрозоля (диаметром 1 – 5 мкм) служила “микрореактором”, подвергаясь тепловому шоку, что обеспечивало структуру перекрывающихся «кофейных» колец (наблюдаемых в оптическом микроскопе и диаметром 30 – 50 мкм), состоящих из кластеров НЧС различного размера в диапазоне 50 – 90 нм. Наноструктурированные серебряные покрытия были охарактеризованы различными физико-химическими методами. Таким образом, в результате выполнения работ по настоящему проекту: 1. Получены наноструктурированные серебряные покрытия. Оптимизированные ГКР-активные поверхности имели шероховатую микроструктуру с агрегатами наночастиц серебра (50 – 90 нм) в виде зерен. Расстояние между наночастицами серебра составляло 30 – 70 нм. Все наночастицы различного размера располагались на этих покрытиях в виде пористых слоев. 2. Морфологию (размер, форму и распределение НЧС по поверхности ГКР-сенсора) разработанных поверхностей характеризовали и подтверждали методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и спектроскопии зеркального отражения (наблюдали широкую полосу поверхностного плазмонного резонанса для полученных НЧС: 450 – 700 нм). 3. Дополнительной модификации поверхности наночастиц серебра слоями оптически прозрачных полимеров (полиэлектролитов) различной природы для регистрации усиленного сигнала не потребовалось. 4. Проверку возможности регистрации усиленных характеристических спектров ГКР для модельных красителей на получаемых наноструктурах проводили на примере родамина 6Ж и цианинового красителя (Cy3). Рассчитанные из экспериментальных данных аналитические коэффициенты усиления (КУ) составили 5 – 6 порядков. 5. Используемая в экспериментах квадратная форма ГКР-сенсорного элемента (4х4 мм2) удобна и адаптирована для применения в работе с коммерчески доступными серийными КР-спектрометрами, в т.ч. портативными. Мы проверили и показали наличие специфического сигнала ГКР в присутствии ГКР-меченной мишени (схема эксперимента представлена на рисуноке 1 файла «приложение к отчету»), что позволило нам сделать вывод о специфической иммобилизации олигонуклеотидов на полученной нами поверхности с помощью “якорных последовательностей”. Проверено, что без ГКР-меченной мишени нужные нам сигналы отсутствуют. При использовании олигонуклеотидов, которые позволяют получить дуплексы различной длины (рисунок 2 файла «приложение к отчету»), мы показали, что усиление сигнала зависит от расстояния и природы ГКР-модификации нуклеиновых кислот (эти результаты описаны в статье по проекту Olga E. Eremina, Timofei S. Zatsepin, Valentina M. Farzan, Irina A. Veselova, Maria I. Zvereva, DNA detection with dye-labeled oligonucleotides by surface enhanced Raman spectroscopy, Mendeleev Comm., 2019, направлена в редакцию). Техническим результатом работы является формулирование правил: 1) как селективно связывать и равномерно структурировать анализируемое вещество по поверхности ГКР-сенсорного устройства, что подтверждается регистрацией идентичных по интенсивности аналитических сигналов по всей площади поверхности наноструктур (n = 10; P = 0.95); 2) как контролировать расположение ГКР-метки относительно поверхности наноструктур серебра, что подтверждается регистрацией различных по усилению аналитических концентраций для идентичных концентраций ДНК с различным расположением ГКР-метки. Эти правила позволяют детектировать ДНК с низкими пределами обнаружения методом спектроскопии ГКР (подана заявка на патент). В дальнейшем предполагается использовать систему, в которой ГКР-меченный олигонуклеотид присоединяется только после индуцируемой определенной последовательностью ДНК (аналитом) перестройки структуры олигонуклеотида, закрепленного на поверхности. Заявленный в заявке на патент оптический сенсор позволяет регистрировать усиленный и воспроизводимый сигнал комбинационного рассеяния, интенсивность которого зависит от концентрации ДНК-мишени. Предложенный нами метод включает в себя приготовление планарной ГКР-активной поверхности из наночастиц благородных металлов (на первом этапе наш выбор остановился на наночастицах серебра как наиболее изученных в ГКР-системах усиления); последующую гибридизацию фрагмента ДНК с различными комплементарными олигонуклеотидами, ковалентно модифицированных ГКР-метками и олигонуклеотидом, иммобилизованным на поверхности; добавления капли раствора образца на поверхность, покрытую наночастицами, направленное структурирование определяемых соединений (нуклеиновых кислот) на ГКР-сенсорной поверхности за счет нековалентных взаимодействий; облучения монохроматическим пучком лазера и определение фрагментов ДНК в изучаемом образце методом спектроскопии ГКР на основе интенсивности сигналов на регистрируемых спектрах. На основе полученных данных о необходимом расстоянии между поверхностью и ГКР-меткой в олигонуклеотиде, были выбраны 2 набора олигонуклеотидов (таблица 1 приложения к отчету), которые позволят дискриминировать последовательности TERT промотора дикого типа и несущие мутации C228T и С250T в двух вариантах для R6G- и Сy3- модификации. Так как усиление сигнала в случае R6G происходит при уменьшении расстояния от R6G до поверхности, то выбран вариант раскрытия шпильки (олигонуклеотиды GnuS-C250T-R6G и GnuS-С228Т-R6G) в присутствии аналитических последовательностей (модельные олиги-аналиты: А-С250T, А-C228T, А-Wt). В случае с Cy3-модификации последовательность “якоря” соединена с последовательностью промотера TERT с двумя мутациями (GnuS-pr-2 mt) и с единичными (GnuS-pr-C250T, GnuS-pr-С228Т) и добавленной искусственно последовательностью шпильки, происходит аналогичная перестройка в присутствии аналитов с образованием длинного дуплекса и раскрытием добавленной искусственно последовательностью шпильки, так что появляется свободный одноцепочечный конец. В этом случае становится возможным присоединение на этот конец Cy3-меченного тестового олигонуклеотида (Су3-test) c образование дополнительной двойной спирали. Таким образом “заякоривание” на поверхности Cy3-меченного тестового олигонуклеотида становится возможным только в присутствии аналита в системе. Этот вариант предпочтительнее, так как происходит появление детектируемого сигнала, так как по данным первого года нанесение меченного олигонуклеотида без якорной последовательности не дает детектируемых сигналов. Оба подхода планируется проверить при продолжении проекта.
2 1 сентября 2019 г.-31 августа 2020 г. Селективная система молекулярного узнавания фрагментов ДНК конъюгатами олигонуклеотидов с наночастицами серебра и/или золота для определения мутаций методом гигантского комбинационного рассеяния
Результаты этапа: Проект направлен на разработку принципов обнаружения фрагментов ДНК с определенной первичной структурой конъюгатами олигонуклеотидов с наночастицами металлов методом спектроскопии поверхностного усиленного (резонансного) гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) и их использование для создания селективной системы узнавания ДНК-аналита. В проекте в качестве ДНК-аналита выбран участок промотора гена каталитической субъединицы теломеразы (TERT) человека (с мутациями C228Т или С250Т и без). Такой выбор был обусловлен возможностью создания инновационного метода неинвазивной диагностики рака мочевого пузыря по результатам выполнения проекта. Обоснование такой возможности было представлено в обзоре Zvereva et al., Int. J. Mol. Sci. 2020. Основной целью второго этапа проекта было реализовать референсный разрабатываемому метод -цифровую капельную ПЦР (статья направлена в редакцию), чтобы показать возможность детекции определенной последовательности ДНК-аналита без предварительной ПЦР-амплификации (подана заявка на патент), что покажет работоспособность концепции проекта. Для сравнения способа закрепления на наноструктурированной поверхности серебра с помощью кластер-узнающих последовательностей был проверен синтез тиолированных олигонуклеотидов со сходной первичной структурой и проведен классический способ закрепления последовательности ДНК-олигонуклеотидов на поверхности серебра, который показал сравнимые результаты. Показано преимущество зондов с двумя способами иммобилизации на поверхности и фиксации структуры (одновременное наличие SH-группы и аптамерной последовательности к наночастицам серебра) перед зондами с одним любым типом иммобилизации.
3 1 сентября 2020 г.-31 августа 2021 г. Селективная система молекулярного узнавания фрагментов ДНК конъюгатами олигонуклеотидов с наночастицами серебра и/или золота для определения мутаций методом гигантского комбинационного рассеяния
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".