ИСТИНА

Основной проблемой для существующей на настоящий момент терапии ВИЧ-инфекции является возникновение лекарственно устойчивых штаммов вируса, что приводит к необходимости постоянной смены препаратов. С целью создания соединений, не вызывающих появление резистентных штаммов ВИЧ-1 и/или обладающих в отношении них ингибирующей активностью, предлагаются разные подходы, и одним из наиболее перспективных считается подход, основанный на подавлении взаимодействия вирусных белков с клеточными белками-помощниками, необходимыми для успешной репликации вируса. Этот подход является еще очень новым и мало разработанным, в первую очередь, из-за нашего недостаточно хорошего знания механизмов взаимодействия вирусных и клеточных белков. Исследование структуры комплексов вирусных белков с новыми клеточными партнерами позволит существенно расширить возможности указанного подхода и создать новые типы анти-ВИЧ препаратов. Ранее мы установили, что вирусный фермент интеграза (ИН), катализирующая важнейшую стадию жизненного цикла ВИЧ-1 – интеграцию ДНК копии вирусного генома в геном зараженной клетки – взаимодействует с белком человека Ku70, и это взаимодействие крайне важно для успешной репарации разрывов, возникающих в клеточной ДНК после интеграции в нее вирусной. Эти данные дают нам основание полагать, что комплекс ИН и Ku70 можно рассматривать в качестве новой перспективной мишени для создания анти-ВИЧ препаратов нового поколения. Основной задачей данного проекта является исследование структуры комплекса ИН и Ku70 методами молекулярного моделирования и сайт-направленного мутагенеза, а также создание низкомолекулярных и биоподобных структур, способных ингибировать взаимодействие этих белков и стать основой для нового подхода к терапии ВИЧ-инфекции. Для создания ингибиторов будут использованы методы компьютерного скрининга и экспериментальные подходы. На завершающем этапе будет исследовано влияние созданных ингибиторов взаимодействия ИН и Ku70 на постинтеграционную репарацию ДНК с использованием репликативно-некомпетентного вектора на основе ВИЧ-1, содержащего в качестве репортерного ген люциферазы светлячка под контролем промотора цитомегаловируса.

An emergence of drug-resistant viral strains is the main obstacle in the current approach towards the treatment of HIV infection that leads to a frequent change of antiviral drugs. Different approaches are presented toward the design of compounds that do not lead to an emergence of drug resistant strains or that are capable of inhibiting such strains. One of the promising techniques is the blocking of interaction between viral proteins and cellular co-factors that are important for an effective viral replication. Yet quite promising, this approach still remains very new and not explored enough which is mainly due to our lack of knowledge regarding the mechanism of interaction between viral and cellular proteins. A research into the structures of complexes between viral proteins and newly found cellular co-factors will allow to considerably broaden the capacity of the aforementioned approach and to create new types of antiviral drugs. Earlier, we have shown that the viral enzyme integrase (IN) interacts with the Ku70 human protein. IN catalyzes an essentially important step of the retroviral life cycle that is the integration of the viral genome into the cellular DNA . Importantly, the interaction between IN and Ku70 is essential for the repair of gaps that emerge in the cellular DNA following integration. These data give us reason to assume that the IN/Ku70 complex is a new promising target for the design of a new generation of anti-HIV drugs. The main task of this project is the investigation of the IN/Ku70 complex using molecular modeling tools as well as sight-directed mutagenesis and the application of the obtained data for the design of small molecule inhibitors and bio-similar inhibiting compounds with a potential to block the interaction between Ku70 and integrase and to form the basis for a new approach toward the treatment of HIV infection. The inhibitor design will be carried out by the means of computer screening tools as well as experimental approaches. The final stage will be dedicated to the evaluation of the effect that the inhibitors designed during this project have on the postintegrational DNA repair of a replication deficient HIV-1 based lentiviral vector that expresses luciferase reporter gene under the control of the cytomegalovirus promoter.

Основным результатом выполнения проекта будет валидация комплекса интегразы ВИЧ-1 и клеточного белка Ku70 как новой мишени для создания препаратов, подавляющих репликацию ВИЧ-1 на стадии постинтеграционной репарации ДНК.

Коллектив участников проекта имеет также большой опыт изучения ранних этапов репликации ВИЧ-1: обратной транскрипции и интеграции. Авторами настоящего проекта детально исследовано взаимодействие рекомбинантных белков: интегразы и Ku70, получен набор их делеционных и точечных мутантов. В результате этого исследования идентифицированы 2 аминокислоты в составе ИН (участок 200-220 аминокислоты), замены которых мешают ее связыванию с Ku70; установлено также, что для связывания с ИН важен N-концевой домен Ku70, состоящий из аминокислот 1-250. Впервые разработан вариант количественной ПЦР, позволяющий определить уровень интегрированной и репарированной после интеграции ДНК. С помощью этого метода впервые установлено, что взаимодействие интегразы и белка Ku70 крайне важно для успешной репликации вируса на стадии репарации разрывов, возникающих в клеточной ДНК после интеграции в нее вирусной.

Соединений, подавляющих репликацию ВИЧ-1 на стадии постинтеграционной репарации ДНК, еще не разработано. Это будет научный результат, который потенциально позволит создать принципиально новый тип анти-ВИЧ препаратов, способных подавлять инфекцию, вызываемую всеми известными на данный момент лекарственно-устойчивыми вариантами ВИЧ-1. Более того, вероятность возникновения вирусной устойчивости к ингибиторам взаимодействия вирусных белков с клеточными белками помощниками существенно ниже, чем в случае ингибиторов вирусных ферментов.