Разработка новых высокоинформативных способов обнаружения, идентификации и определения биоактивных компонентов растительного сырьяНИР

Development of novel highly informative approaches for detection, identification and determination of bioactive compounds of plant material

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Разработка новых высокоинформативных способов обнаружения, идентификации и определения биоактивных компонентов растительного сырья
Результаты этапа: Основные поставленные задачи полностью выполнены. В рамках проекта изучено масс-спектрометрическое и хроматографическое поведение протопанаксадиольных (ППД) и протопанаксатриольных (ППТ) стероидных сапонинов женьшеня, а также спиростаноловых и фуростаноловых стероидных сапонинов якорцев стелящихся. Было установлено, что стероидные сапонины разных классов склонны к образованию фрагментных ионов сапогенина, образующих характеристичный паттерн фрагментации, являющийся уникальной групповой характеристикой для сапонинов с одинаковым типом сапогенина. Для нецелевого и целевого скрининга сапонинов были выбраны сигналы [S-2H2O+H]+ и [S-3H2O+H]+, где S – молекула сапогенина, которые имеют значения m/z 423.3, 405.3 для ППТ сапонинов, m/z 425.3, 407.3 для ППД сапонинов и m/z 415.3, 397.3 для протодиосцина и диосцина якорцев стелящихся. Использование этих сигналов в варианте масс-спектрометрического (МС) детектирования по выбранным ионам обеспечивает достаточную межгрупповую селективность определения и хорошую чувствительность в сравнении с общепринятыми УФ и МС детектированию по молекулярным ионам. Для улучшения ионизации в выбранных условиях ионизации электрораспылением подобрали оптимальный состав подвижной фазы из двух основных компонентов: ацетонитрила и воды с добавкой модификаторов, таких как муравьиная кислота, уксусная кислота, ацетат и формиат аммония. Хроматографическое разделение проводили на, отличающихся по размерам частиц, колонках с неподвижными фазами на основе силикагеля с привитыми группами С18. Для определения сапонинов женьшеня и якорцев стелящихся использовали добавку 0.1% муравьиной кислоты. В выбранных условиях псевдогинсенозиды F11 и RT5, гинсенозиды Rg2 и Rh1, а также Rg1 и Re имеют близкие времена удерживания, а разрешение для всех остальных пар пиков превышало значение 1.0. На хроматограммах экстрактов из травы якорцев стелящихся отсутствовал пик диосгенина – сапогенина диосцина, однако, были идентифицированы производные диосгенина и хецогенина на основании совпадения m/z сигналов [M+H]+, [M-H2O+H]+ и [M+Na]+ ионов в масс-спектрах этих пиков с рассчитанными моноизотопными массами этих ионов для данных соединений, а также по сопоставлению наблюдаемых в спектрах сканирования фрагментных ионов, соответствующих последовательному отщеплению сахаридных заместителей, с образованием фрагментных ионов сапогенина и дегидратированного сапогенина, с расчетными массами данных фрагментов. Для оценки содержаний сапонинов методом количественного анализа многокомпонентной системы (КАМС). Выбирали референтное соединение, которое выступает в роли внутреннего стандарта, концентрация которого меняется от пробы к пробе и должна быть определена с помощью построения градуировочной зависимости. Для расчета концентраций аналитов в методе КАМС отношение площадей пика определяемого компонента и пика референтного соединения умножали на отношение фактора пересчета к концентрации референтного соединения, рассчитанной по методу внешнего стандарта. Сравнили три способа определения коэффициента пересчета: 1) метод расчета по одной точке; 2) многоточечный метод расчета; 3) расчет фактора пересчета по методу линейной регрессии. Для определения фактора пересчета по первому способу готовили стандартные растворы референтного и определяемого соединений таким образом, чтобы их концентрации находились вблизи середины рабочего диапазона концентраций, значение фактора определяется по отношению произведений площадей пиков на величину обратную концентрации для референтного и определяемого компонентов, соответственно. Фактор пересчета, рассчитанный по второму способу, представляет собой среднее значение факторов, полученных на разных уровнях концентраций по методу расчета по одной точке. Для этого готовили серии стандартных растворов референтного и определяемых соединений и рассчитывали факторы по методу расчета по одной точке, а затем строили график зависимости фактора пересчета от концентрации определяемого соединения. В случае если на малых уровнях концентраций наблюдали сильные флуктуации значения фактора, ограничивали рабочий диапазон концентраций снизу. В третьем способе расчета, как и по многоточечному методу расчета, строили градуировочные графики и устанавливали градуировочные зависимости референтного и определяемых соединений. Однако в данном случае фактор определяется, как отношение угловых коэффициентов наклонов графиков градуировочных зависимостей. Показали, что значения факторов пересчета, вычисленные для разных ионов, отличаются незначительно, однако наименьшая ошибка вычисления концентрации, по сравнению с методом градуировочного графика, оказалась при использовании суммарного сигнала двух ионов и метода расчета фактора по отношению наклонов градуировочных графиков. Разработанный способ ВЭЖХ-МС-КАМС для определения сапонинов женьшеня отличался хорошей чувствительностью (на уровне 10–80 мкг/мл), линейностью на всем диапазоне определяемых содержаний и достаточной воспроизводимостью (5 % в течение одного дня). На стадии тестирования разработанного подхода определяли основные принятые в Европейской Фармакопее и Фармакопее США параметры контроля качества женьшеневого растительного сырья, такие как содержание гинсенозидов Rg1, Rb1, их суммы и соотношения в материале. Полученные с применением методов градуировочного графика и КАМС значения этих параметров отличались не более чем на 11 %. Таким образом, предложенный оригинальный способ детектирования и количественной оценки содержаний сапонинов был успешно опробован при анализе нескольких образцов сушеных и свежих корней P. ginseng и P. Quinquefolius, а также пищевой добавки и чая на основе женьшеня. Оценку характеристик разработанного КАМС подхода определения протодиосцина, диосцина и диосгенина проводили при анализе экстрактов из надземных частей растения T. terrestris. Установили, что экстрагирование водно-метанольной смесью под воздействием ультразвука без нагревания привело к неполному извлечению менее полярного компонента – диосцина. Расчет содержаний протодиосцина проводили по методу градуировочного графика и по методу КАМС, при этом значения ООМ оказались менее 10 %. На основе полученных данных, установили, что экстрагирование 10 мл водно-метанольной смесью позволяет добиться почти полного извлечения протодиосцина из 0.1 г растительного материала T. terrestris за один акт экстрагирования. Диосгенин не был обнаружен в исследованных экстрактах.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Разработка новых высокоинформативных способов обнаружения, идентификации и определения биоактивных компонентов растительного сырья
Результаты этапа: Основные поставленные задачи полностью выполнены. В рамках проекта изучено масс-спектрометрическое и хроматографическое поведение протопанаксадиольных (ППД) и протопанаксатриольных (ППТ) тритерпеновых сапонинов женьшеня, производных абрусогенина из абруса молитвенного, аналогов глицирризина (производных глицирретовой кислоты) и родственных групп сапонинов солодки голой. Было установлено, что тритерпеновые сапонины разных классов склонны к образованию фрагментных ионов сапогенина, образующих характеристичный паттерн фрагментации, являющийся уникальной групповой характеристикой для сапонинов с одинаковым типом сапогенина. Разработан способ тандемного МС определения глицирризина в экстрактах из корня солодки и в женьшеневом чае (улуне), а также проведена проверка мешающего влияния других сапонинов. Для этого использовали предложенные ранее ионные переходы c m/z 821/351 и 821/193 в режиме регистрации отрицательных ионов. Разделение осуществляли в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке, заполненной сорбентом с привитыми группами С18, используя в качестве подвижной фазы ацетонитрил и воду с добавкой муравьиной кислоты. Для проверки мешающего влияния других сапонинов в одинаковых условиях были дополнительно проанализированы экстракты из листьев A. precatorius, корня женьшеня P. ginseng и корейского женьшеневого чая. Содержание глицирризина в двух исследованных образцах корня солодки оказалось одинаковым и близким к 3%, что сопоставимо с указанным в европейской фармакопее значением – 4%, поскольку исследованные коммерчески доступные образцы корня солодки содержали больше корневых отростков, чем частей основного корня. Путем суммирования результатов двух последовательных экстракций в ультразвуковой ванне и расчета содержания определяемого компонента в первой порции экстрагента было показано, что около 90% глицирризина извлекается из растительного материала на первой стадии экстракции изопропанолом в воде (70% по объему) в течение 40 минут. Степень извлечения глицирризина из чая может быть ниже вследствие термической обработки исходного материала в процессе производства чая, поэтому на первой стадии экстракции из измельченных чайных гранул извлекается около 80% глицирризина. Содержание глицирризина сильно отличается в чаях разных производителей, а на хроматограмме экстракта из оригинального китайского женьшеневого улуна (Huanglongtai tea co., ltd., КНР) пик глицирризина отсутствовал даже на уровне предела обнаружения. Также были обнаружены компоненты, частично мешающие определению глицирризина в выбранном варианте детектирования. Таким образом, в проведенном исследовании установлено, что метод ВЭЖХ-МС/МС, с применением двух ионных переходов, позволяет успешно идентифицировать целевые сапонины, однако, учитывая многообразие используемых в традиционной китайской медицине (ТКМ) растений, нельзя гарантировать, что другие компоненты, содержащие цепочку из двух сахаридных остатков глюкуроновой кислоты, не будут мешать такому определению глицирризина и его аналогов в комплексных препаратах. Разработан новый способ групповой идентификации сапонинов на основе данных ВЭЖХ-МС анализа и установленных закономерностей фрагментации, а также других особенностей масс-спектрометрического поведения. Для того чтобы сопоставить сапониновые профили исследуемых экстрактов были получены хроматограммы при одновременной регистрации сигналов из полученных в настоящей работе паттернов фрагментации нескольких сапогенинов. Использование длительных программ градиентного элюирования позволяет для идентификации компонентов применять как время удерживания основных пиков, так и присутствие всех характеристичных сигналов для каждой группы сапонинов. Оригинальность разработанного подхода заключалась в регистрации групп компонентов, характеристичных для каждого образца, которую проводили по ограниченному набору ионов из выявленных паттернов фрагментации сапогенинов, в отличие, от используемого метода «отпечатков пальцев», где образцы сравнивают по присутствию, соотношению и составу нескольких характеристичных компонентов – биомаркеров растений, стандарты которых чаще всего коммерчески доступны (а условия детектирования индивидуальны). Таким образом, применение разработанного подхода позволяло обнаружить ближайшие аналоги и метаболиты выбранных биомаркеров. Такой многокомпонентный подход позволяет в течение одного анализа получить исчерпывающие ВЭЖХ-МС профили компонентов каждой из интересующих групп, при этом достоверность отнесения пика к выбранной группе компонентов даже в сложносоставных продуктах питания и лекарственных средствах сопоставима с регистрацией масс-хроматограмм в режиме сканирования. Таким образом, разработанный подход обладает рядом преимуществ и перед ВЭЖХ-УФ, и перед методом ВЭЖХ-МС/МС регистрации целевых маркеров, и перед методом полного ВЭЖХ-МС профилирования при получении спектров сканирования, поскольку обработка таких спектров проводится вручную и неприменима в рутинной практике контроля лекарственного сырья и препаратов ТКМ. Было продемонстрировано присутствие абрусозидов из листьев A. precatorius, а также компонентов экстракта корня солодки в составе женьшеневого улуна, что обуславливает сладкий привкус этого вида чая. Оригинальные гинсенозиды женьшеня не были обнаружены в этом продукте, что также можно проиллюстрировать, сравнив хроматографические профили, полученные в режиме регистрации сигналов, характерных для ППТ и ППД гинсенозидов. Хроматографические пики с установленными временами удерживания практически отсутствовали на хроматограммах экстрактов из отдельных растений, если регистрация хроматограмм проводилась по сигналам паттерна фрагментации нехарактерной для них группы сапонинов. Таким образом, предложенный способ позволяет, на основании сопоставления профилей тритерпеновых сапонинов, идентифицировать присутствие в составе пищевых добавок и продуктов экстрактов из корней солодки, женьшеня или листьев четочника молитвенного, которые могут отвечать за наличие сладкого вкуса или аромата. Для структурного анализа компонентов четочника молитвенного и женьшеневого улуна выделенные паттерны фрагментации сапогенина были подтверждены с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения. В ходе исследования четырех образцов женьшеневого улуна была выделена группа сапонинов с одинаковым паттерном фрагментных ионов сапогенина. Для выделения достаточного для ЯМР анализа количество сапогенина использовали гидролиз в кислой среде и очистку на обращенно-фазном сорбенте, без последующего препаративного хроматографического разделения. Аналогичные процедуры, описанные в литературе, применялись лишь для отщепления сахаридных заместителей и их идентификации методом ГХ-МС. В настоящей работе ВЭЖХ чистота выделенного таким способом сапогенина оказалась на уровне 90 %, а состав заместителей был установлен с помощью тандемной масс-спектрометрии для 9-ти обнаруженных компонентов, которые оказались аналогами известных абрусозидов из листьев Abrus precatorius, сапогенином которых является абрусогенин. Для подтверждения предложенных структур ацетил-абрусозид С был выделен с помощью полупрепаративной хроматографии с контролем чистоты выделяемых фракции с помощью МС детектирования. Конфигурация и положение ацетил-сахаридной боковой цепи были подтверждены, а химические сдвиги функциональных групп сапогенина были близки к полученным при ЯМР анализе выделенной после кислотного гидролиза фракции абрусогенина.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Разработка новых высокоинформативных способов обнаружения, идентификации и определения биоактивных компонентов растительного сырья
Результаты этапа: Основные поставленные задачи проекта полностью выполнены. В продолжение исследований метода количественного анализа многокомпонентной системы (КАМС) были изучены стабильность и воспроизводимость относительных факторов (ОФ) отклика на примере тритерпеновых гликозидов женьшеня. Влияние хроматографических параметров и параметров МС детектирования на ОФ было всесторонне исследовано, и достаточная воспроизводимость наблюдалась даже для широкого диапазона вариаций. Улучшенная стабильность значений ОФ для сапонинов с различной структурой агликона была достигнута благодаря использованию групповых стандартов для гинсенозидов с различным типом агликона. Отношение интенсивностей сигналов фрагментных ионов сапогенина сильно зависит от конструкции источника и условий ионизации в МС, таких как потенциал декластеризации (ПД) и входной потенциал на нулевом квадруполе. Данные были получены с использованием трех различных источников электрораспылительной ионизации (разных фирм-производителей) при трех значениях ПД. Оказалось, что, суммируя выбранные сигналы, можно уменьшить влияние таких параметров как ПД, и могут быть получены стабильные значения ОФ. По сравнению с подходом КАМС, основанным на ВЭЖХ-УФ, в случае ВЭЖХ-МС-КАМС требуется более строго соблюдать условия проведения анализа. Разработанный КАМС подход в варианте МС детектирования был опробован в ходе измерений, проведенных на пяти разных приборах. Различия между КАМС и методом внешнего стандарта по результатам количественного анализа были ниже 15% для всех определяемых гинсенозидов. Таким образом, предложенная методика ВЭЖХ-МС-КАМС представляет собой аналитический подход для группового определения целевых компонентов, который использует условия групповой селективной хроматографии и групповые реперные стандарты для количественного определения. Разработанный метод был опробован на короткой партии различных по составу растительных продуктов, проанализированной с использованием трех различных приборов ВЭЖХ-МС. Результаты указывают на хорошую корреляцию между предложенной КАМС и традиционной количественной оценкой методом внешнего стандарта. С использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС) разработан и апробирован на стандартных образцах референтных экстрактов из американского и азиатского женьшеней способ определения основных и минорных гликозидов. Повышение селективности, по сравнению с используемыми для стандартизации экстрактов из растительного сырья ВЭЖХ-УФ методиками, позволило одновременно регистрировать хроматографические пики и определять содержания 23 основных и минорных гинсенозидов. Для этого помимо применения высокоселективного МС детектирования ионов аддуктов молекул гинсенозидов с натрием и фрагментных ионов сапогенина были специально подобраны условия для хроматографического разделения на сорбенте с привитыми пентафторфенильными группами. Отдельно исследовали влияние температуры и состава подвижной фазы на селективность разделения исследуемых гликозидов. Для некоторых пар соединений (F4 и Rg6, Rk3 и Rh4) добиться полного хроматографического разделения пиков не удалось, однако их определение при совместном присутствии возможно благодаря регистрации различающихся по m/z сигналов. Для всех определяемых соединений были установлены диапазоны линейности и уравнения градуировочных зависимостей, а также определены метрологические характеристики, такие как предел обнаружения и воспроизводимость. Показано, что предложенный подход может быть успешно использован для селективного обнаружения и идентификации гинсенозидов в присутствии других компонентов растительных экстрактов. Разработанный способ позволил уточнить и расширить заявленный состав гликозидов в исследованных образцах экстрактов благодаря превосходящей селективности по сравнению с применяемыми ВЭЖХ-УФ подходами с разделением на колонках, заполненных С18 сорбентом. Обнаружение гинсенозидов женьшеня проводили на уровне 10 нг/мл и выше, также предложенный способ характеризовался удовлетворительной воспроизводимостью и линейностью во всем диапазоне определяемых содержаний.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".