|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Ион-транспортирующие АТРазы Р-типаНИР
Ion-transporting P-type ATPases.
- Руководитель НИР: Лопина О.Д.
- Участники НИР: Владыченская Е.А., Гончарова Н.Ю., Дергоусова Е.А., Климанова Е.А., Рубцов А.М., Тюлина О.В.
- Подразделение: Кафедра биохимии
- Срок исполнения: 1 января 2016 г. - 31 декабря 2020 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 05-2-16
- Номер ЦИТИС: АААА-А16-116021660021-6
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Физико-химические основы биологии и биотехнологии
- Приоритеты и перспективы НТР Российской Федерации согласно Стратегии НТР РФ: переход к высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
- Критическая технология России: Биомедицинские и ветеринарные технологии
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.27.17 Морфология и физиология микроорганизмов
- Классификатор OECD: Биохимия и молекулярная биология
-
Ключевые слова:
кардиостероиды, глутатионилирование, нитрозилирование, альфа-субъединица
biological membranes, post-translational modifications, protein biochemistry -
Описание:
В течение ближайших 5 лет предполагается продолжить изучение связывания кардиостероидов уабаина и маринобуфагенина с Nа,К-АТРазой, выделенной из чувствительных и нечувствительных к уабаину тканей (то есть из тканей, в которых не наблюдается физиологических эффектов уабаина, в частности, под действием уабаина смерть клеток эпителия наступает не во всех типах тканей). Предполагается также исследовать, как модификация SH-групп альфа-субъединицы этого фермента (а именно глутатионилирование, окисление до -SOH, а также -SO2H и -SO3H, а также нитрозилирование) влияет на связывание с ферментом указанных кардиотонических стероидов и на связывание некоторых белков, в частности Src-киназы и HSP-70. Кроме того, предполагается провести работу по идентификации белков, участвующих в передаче сигнала от Na,K-АТPазы внутри клетки в ситуации, когда уабаин вызывает смерть клеток эпителия и установить причину прерывания передачи сигнала при изменении рН среды.
-
Abstract:
It is plaaned during 5 years to continue study binding of cardiosteroids ouabain and marinobufagenin to В Nа,К-АТРase purified from sensitive and resistent to ouabain tissues (that are tissues in which are not observed ouabain effect, for example ouabain induces cell death not in all tissues). We propose also to study how modification of SH-group of alpha-subunit of the enzyme (for example glutathionylation, oxidation to -SOH, -SO2H, and -SO3H, gnitrosylation) affects the binding of cardiotonic steroid and some proteins, for example Src-kinase and HSP-70. Besides this, we propose to identify proteins participating in the signal transduction from Na,K-АТPase inside the cell under conditiob when ouabin induces cell death and to find a case of signal interrapting under condition when hY value changes.
-
Планируемые результаты:
Получить данные по изменению транскриптома и протеома клеток млекопитающих, опосредованному диссипацией внутриклеточного градиента одновалентных катионов в условиях гипернатриемии и при ингибировании Na,K-ATPазы. Установить значения концентраций различных КТС (уабаина, маринобуфагенина, дигоксина), при которых наблюдается активация Na,K-ATPазы, имеющей в своем составе альфа-1-субъединицу.
-
Научный задел:
Проведено изучение физико-химических параметров (упругости) плазматической мембраны клеток эндотелия человека. Показано наличие на клетках рецепторов для альдостерона, ангиотензина (АТ1 и АТ2), исследовано действие альдостерона на упругость мембраны эндотелиальных клеток. Проведены первоначальные эксперименты по изучению действия маринобуфагенина и уабаина на содержание в клетках эндотелия ионов натрия и калия, а также на протеом и транскриптом этих клеток.
-
Основные результаты:
Обнаружено, что на ранних этапах диссипации внутриклеточного градиента одновалентных катионов в клетках эндотелия пупочной вены человека в результате ингибирования Na,K-ATPазы (уабаином или инкубацией клеток в бескалиевой среде) происходит изменение экспрессии транскриптов, среди продуктов которых - транскрипционные факторы, малые ядерные РНК, являющиеся компонентами сплайсосомы, а также малые РНК, которые участвуют в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне.
- Добавил в систему: Ратанина Мария Александровна
Источник финансирования НИР
| госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Ион-транспортирующие АТРазы Р-типа |
| Результаты этапа: | ||
| 2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Ион-транспортирующие АТРазы Р-типа |
| Результаты этапа: Установлено, что редокс-модификации α-субъединицы Na,K-АТФазы из солевых желез утки полностью не устраняются в присутствии химических восстанавливающих агентов даже в денатурирующихусловиях. Эти данные позволяют предположить, что эндиматическая восстанавливающая система специфически влияет на цостояние глутатионилированных остатков цистеина альфа-субъединицы Na,K-ATPaзы. Процесс деглутатионилирования/дополнительного глутатионилирования Na,K-АТФазы вызывает изменение скорости и набора продуктов трипсинолиза и скорости термоинактивации. Установлено, что активность Na,K-ATфазы в медуллярном слое почек уменьшается в модели холестаза беременности и при других типах гиперлактемии. Не выявлено корреляции между активностью Na,K-ATФазы и клиренсом натрия. Показано, что кардиотонические стероиды запускают различны сигнальные каскады за счет изменения конформации фермента. Показано, что увеличение соотношения [Na+]i/[K+]i является обязательным для изменения в транскриптоме, вызванном кардиостероидами в клетках линии HUVEC. | ||
| 3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Ион-транспортирующие АТРазы Р-типа |
| Результаты этапа: В результате исследований установлено какие остатки цистеина α1-субъединицы Na,K-ATPазы 12 подвергаются химическим модификациям (глутатионилированию, нитрозилированию и окислению). Выявлено, глутатионилирование каких остатков подавляет ферментативную активность, которая частично может быть восстановлена при устранении глутатионилирования. Значительное глутатионилирование цистеиновых остатков существенно влияет на конформационное состояние фермента. Тот факт, что глутатионилирование ряда остатков не устраняется даже сильными восстанавливающими агентами в денатурирующих условиях,позволяет заклюяить, что глутатионилировае осуществляет в процессе синтеза субъединицы. Выявлено, что три кардиотонических стероида (уабаин, дигоксин и маринобуфагенин) по-разному связываются с Е2-Р-конформацией Na,K-АТФазы. Это свидетельствует о том, что они по-разному запускают сигнальные каскады, приводящие к смерти почечного эпителия. Отсутствие связывание уабаина и других стероидов с Е2-Р конформацией Na,K-АТФазы из почек крысы объясняет, почему эти сигнальные каскады не развиваются в клетках почек крысы, невзирая на ингибирование ферментативной активности. Ca2+-независимые сигнальные пути играют ключевую роль в изменении экспрессии 30%активируемых при электростимуляции миотубул генов. Этот путь (по крайней мере, частично) запускается путем устранения (диссипации) трансмембранного градиента одновалентных катионов. | ||
| 4 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Ион-транспортирующие АТРазы Р-типа |
| Результаты этапа: Выявлены общие и уникальные гены четырех видов клеток грызунов и основные связанные с ними сигнальные пути. Показано, что гибель клеток человека и выживание клеток грызуноd при действии уабаина связаны с наличием различных конформаций Na,K-АТФазы и ее способностью в таких состояниях активировать различные сигнальные пути: при выживании ERK1/2, при гибели - p38 | ||
| 5 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Ион-транспортирующие АТРазы Р-типа |
| Результаты этапа: Полученные в процессе выполнения проекты результаты позволяют сделать следующие выводы: 1. Существует Са2+-независимый индуцируемый повышением внутриклеточного соотношения [Na+]/[K+] механизм индукции экспрессии генов в клетках животных. В четырех типах клеток грызунов грызунов (гладкие мышцы сосудов крысы, эндотелий сосудов крысы, гранулярные клетки мозжечка и мобласты мыши) выявлено 83 общих гена, экспрессия которых увеличивается в ответ на увеличения соотношения [Na+]/[K+]. 2. Исследование кинетики экспрессии генов в ответ на повышение внутриклеточного соотношения [Na+]/[K+]показывает, что в первые часы после действия стимула экспресссируются гены, кодирующие микроРНК, транскриптомные факторы и белки, вовлеченные в иммунный ответ и воспаление. Среди генов раннего ответа подробно исследован ген FOS, в последовательности которого выявлено значительное количество структур, обогащенных гуанозином (G-квадруплексы), стабильность которых изменяется в ответ на изменение соотношение [Na+]i/[K+]i. Эти последовательности располагаются как в промоторе гена, так и в его интронах и кодирующей последовательность белка части. Высказано предположение о том, что именно G-квадруплексы в составе ДНК, а не белки, могут быть сенсорами соотношения [Na+]i/[K+]i.. 3. Исследование механизма, приводящего к смерти клеток животных, не относящихся к отряду грызунов, под действием уабаина (онкоз) показывает, что для этого недостаточно увеличения внутриклеточного соотношения [Na+]i/[K+]i. Фактором, необходимым для индукции смерти клеток, является специфическое изменение конформации уабаин-чувствительной α1-субъединицы Na,K-ATPазы, что в свою очередь, активирует сигнальный каскад р38 МАРК. Выявлены белки, связывающиеся с α1-субъединицы Na,K-ATPазы в отчет на связывание уабаина. Показано, что изменение конформации уабаин-резистентной α1-субъединицы Na,KATPазы крысы, существенно отличается от таковой, индуцируемой связыванием уабаина с уабаин-чувствительной α1-субъединицей Na,K-ATPазы, а результатом этого является активация каскада Erk ½ сигнального пути, что приводит к выживанию клеток грызунов. Выявлено соответствие между термодинамическими параметрами связывания КТС с уабаин-резистентной и уабаин-чувствиетльной формами α1-субъединицы Na,K-ATPазы и структурой центра. 4. Исследованы редокс-модификации 12 остатков цистеина α1-субъединицы Na,K-ATPазы (глутатионилирование, нитрозилирование и окисление) и установлено, модификация каких остатков приводит к ингибированию фермента. Показано, что в натриевой и калиевой конформации фермента глутатионилирование происходит различным образом, причем глутатионилирование влияет на связывание уабаина и, возможно, на передачу сигнала клеточной смерти. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".