Оксидативный стресс в патогенезе снижения репродуктивного потенциала яичника при эндометриоидных кистахНИР

Oxidative stress in the pathogenesis of a poor ovarian reserve in women with endometriomas

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 15 марта 2018 г.-31 декабря 2018 г. Разработка хемилюминесцентных методик оценки прооксидантной активности ткани яичника и содержимого эндометриоидной кисты, оценки антиоксидантной активности перитонеальной жидкости и ткани яичника у пациенток с наружным генитальным эндометриозом
Результаты этапа: . Разработка хемилюминесцентных методик оценки продукции радикалов тканью с аэрацией кислородно-газовой смесью Разработанные в ходе выполнения проекта методики основаны на прямом, чувствительном и доступном методе – хемилюминометрии (ХЛ) в присутствии люцигенина, селективного зонда на супероксидный анион-радикал. В ходе выполнения проекта ранее разработанная нами хемилюминесцентная методика для оценки продукции супероксидного радикала митохондриями в присутствии люцигенина при аэрации кислородной газовой смесью была оптимизирована и дополнена абсолютно новым подходом, заключающимся в использовании донора электронов НАДН. А) отработка преаналитического этапа: методика отбора пробы, срок и условия хранения проб Была разработана методика отбора пробы шприцом для проведения биопсии путем сопоставления результатов для кусочка, гомогената и биоптатов на примере ткани печени печени крыс. Биоптаты характеризовались в три раза более интенсивным свечением, что связано с более эффективной диффузией люцигенина и кислорода. Показано, что отбор тканей в виде биоптатов является перспективным как с точки зрения аналитических целей (более высокая чувствительность определения), так и с точки зрения возможного применения для клинического анализа. Установлено, что срок хранения образцов не должен превышать нескольких часов для ХЛ-анализа, что достаточно для транспортировки. Для хранения непринципиально насыщение кислородом консервационной среды. Б) Методика люцигенин-активированной ХЛ в присутствии НАДН Была разработана оригинальная ХЛ-методика оценки радикал-продуцирующей активности цитохром b5-редуктазы непосредственно в тканях. К аэрируемому кислородной газовой смесью образцу ткани в растворе Кребса-Рингера в присутствии люцигенина добавляли раствор НАДН, при этом интенсивность ХЛ возрастала на порядок. 2. Оценка прооксидатной емкости содержимого кисты на линолевую кислоту (стандартный липид) в сопоставлении с гемоглобином крови Для оценки прооксидантной емкости содержимого эндометриоидной кисты была разработана оригинальная методика с использованием шприцевого ввода на основе системы гемоглобин + кумарин С-334 + окисленная линолевая кислота в трис-буферном растворе (рН 7,4). Для изучения локального оксидативного стресса в яичнике при эндометриомах была поставлена задача оценки прооксидантной активности содержимого кисты. Были зарегистрированы хемилюминограммы для содержимого кисты и чистого гемоглобина такой же концентрации в пересчете на гемовое железо. Схожая форма кривых свидетельствует об аналогичной кинетике превращения и об аналогичной прооксидантной способности у гемоглобина и содержимого кисты. 3. Разработка хемилюминесцентных методик определения общей, белковой, липидной антиоксидантной активности и оксидативно-окисленного альбумина в перитонеальной жидкости. Методика определения общей и белковой антиоксидантной активности была адаптирована из ранее разработанной методики оценки антиоксидантного профиля плазмы крови. При отработке методики варьировали концентрации компонентов ХЛ-системы и способ хранения и пробоподготовки перитонеальной жидкости. Отбор перитонеальной жидкости может быть осуществлен в обычные пробирки типа Эппендорф без дополнительного консерванта или стабилизатора. Далее проводят центрифугирование в течение 10 мин при 8000g, надосадочную часть можно анализировать в день отбора или хранить при -20°С в течение 3 месяцев. Для анализа допускается единственное размораживание образца. Антиоксидантный профиль перитонеальной жидкости аналогичен антиоксидантному профилю плазмы крови, что дает основание применить аналитические подходы, разработанные ранее для крови. 4. Оценка прооксидантной емкости содержимого кисты в сопоставлении с гемоглобином крови. С использованием ХЛ-методики, описанной в п.2, были получены хемилюминесцентные кривые при действии содержимого кисты на линолевую кислоту. Было проведено две серии экспериментов. В первой системе содержалась окисленная линолевая кислота в конечной концентрации 500 мкмоль/л, активатор в конечной концентрации 50 мкМ, и гемоглобин в конечной концентрации от 1 до 2 мкМ, во второй — содержимое кисты. Кинетика окисления липидов содержимым эндометриоидной кисты была аналогична кинетике окисления липидов гемоглобином и железом и представляла собой быструю вспышку с экспоненциальным затуханием, характерную для перекисного окисления липидов. Результаты оценки площади под кривыми и интенсивностей указывают на то, что прооксидантная активность содержимого кисты сопоставима с прооксидантной активностью гемоглобина. Таким образом, содержимое кисты является сильным прооксидантом, который может вызвать в капсуле свободно-радикальные повреждения и инициировать оксидативный стресс.
2 8 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Выявление источников оксидативного стресса и основных мишеней действия АФК в ткани яичника, содержащего эндометриоидную кисту
Результаты этапа: Полученные за период, на который предоставлен грант, результаты с описанием методов и подходов, использованных при реализации Проекта (описать, уделив особое внимание степени оригинальности и новизны) 1. Изучение люцигенин-активированную хемилюминесценцию в стенке эндометриодной кисты и ткани яичника, прилежащей к эндометриоидной кисте у пациенток с односторонними эндометриоидными кистами и у пациенток контрольной группы Основными источниками свободных радикалов, в частности, супероксидного анион-радикала, являются дыхательная цепь митохондрий и ферменты микросомальных дыхательных цепей. Разработанные в ходе выполнения проекта методики основаны на прямом, чувствительном и доступном методе – хемилюминометрии (ХЛ) в присутствии люцигенина, селективного зонда на супероксидный анион-радикал. Ранее была разработана хемилюминесцентная методика для оценки продукции супероксидного радикала митохондриями в присутствии люцигенина при аэрации кислородной газовой смесью [1]. В ходе выполнения проекта эта методика была оптимизирована (этап пробоотбора) и дополнена абсолютно новым подходом, заключающимся в использовании донора электронов НАДН. А) Люцигенин-активированная хемилюминесценция стенки эндометриоидной кисты Было изучено 38 образцов ткани. В течение первых нескольких минут эксперимента изучалась собственная радикал-продуцирующая способность (I0) стенки эндометриодной кисты, которая составила I0=0,17 (0,09-0,41) *103 имп/с. Ранее показано, что люцигенин-активированная хемилюминесценция тканей обусловлена супероксидным анион-радикалом, продуцируемым в митохондриях [2]. Анализ продукции супероксид радикала в стенке эндометриодных кист различного размера показал, что стенка большего размера (n=26) обладает более интенсивным люцигенин-активированным свечением по сравнению с кистами менее 3 см (n=12) (I0=0,05 (0,04-0,09) *103 имп/с против , I0=0,31 (0,12-0,49) *103 имп/с , p=0,004) (рис 1). Люцигенин-активированная хемилюминесценция показывает, что для кист большего размера характерны более высокие концентрации АФК. Эти данные могут быть связаны с прооксидантными свойствами содержимого эндометриодной кисты и повреждением дыхательной цепи митохондрий, т.к. ранее было показано, что содержимое кист большего размера характеризуется большей прооксидантной активностью, так и с собственно большей продукцией АФК митохондриями более длительно существующих эндометриодных кист. Рис. 1Ллюцигенин-активированная хемилюминесценция стенки кисты менее и более 3 см (базовая хемилюминесценция = 120 мкл люцигенина). Б) Люцигенин-активированная хемилюминесценция ткани яичника, окружающей эндометриоидную кисту Люцигенин-активированная хемилюминесценция ткани яичника, окружающей эндометриоидную кисту составила I0=0,12 (0,05-0,29) *103 имп/с, что несколько ниже, чем собственное свечение стенки эндометриодной кисты. Таким образом, в строме яичника, содержащей эндометриоидную кисту, не происходит избыточного образования радикал-анионов, тогда как сама эндометриодная киста способна продуцировать АФК. В) Люцигенин-активированная хемилюминесценция ткани яичника, окружающей доброкачественные неэндометриоидные кисты яичников и ткани «здорового» яичника Фоновая люцигенин-активированная хемилюминесценция образцов ткани яичника, непосредственно прилежащей к неэндометриодному образованию яичника (n=16) составила I0= 0,18 (0,08-0,38) * 103 имп/с, у пациенток контрольной группы (n= 11) - I0=0,18 (0,09-0,29) *103 имп/с, что не отличается от фоновой хемилюминесценции ткани яичника, прилежащей к эндометриодной кисте. Эти данные указывают на одинаковую фоновую радикал-продуцирующую активность образцов ткани яичников, содержащих как доброкачественные жидкостные образования яичников, так и эндометриодные кисты и эти показатели свидетельствуют о минимальной утечкой электронов с дыхательной цепи митохондрий 2. Оценить интенсивность хемилюминесценции при добавлении донора электронов НАДН стенки эндометриодной кисты, ткани яичников, прилежащей к эндометриодной кисте, к ткани яичника с неэндометриодным доброкачественным образованием, у ткани «здорового» яичника. А) НАДН-активированная хемилюминесценция стенки эндометриоидной кисты При добавлении донора электронов НАДН интенсивность хемилюминесценции IНАДН стенки эндометриодной кисты значительно возрастала и составляла IНАДН =2,8 (2,1-4,3) *103 имп/с. В присутствии НАДН люцигениновое свечение IНАДН обусловлено работой НАДН-зависимой цитохром b5-редуктазы, локализованной на микросомальной дыхательной цепи № 2 и на внешней мембране митохондрий [3]. Полученные нами данные говорят о повышенном «запасе» НАДН-зависимой цитохром b5-редуктазы в стенке эндометриодной кисты. Следовательно, можно предположить, что наличие редуктазной системы в стенке эндометриодной кисты необходимо для устранения редокс-дисбаланса в эндометриальных клетках, которые подвергаются атаке АФК. При добавлении НАДН интенсивность хемилюминесценции возрастала как в стенке эндометриодной кисты менее 3 см до – IНАДН=1,8 (0,8-2,2) *103 имп/с., так и более 3 см до - IНАДН=4,2 (2,8-6,2) *103 имп/с (Рис. 2). Различия в свечении между малыми и большими кистами также были достоверными (р=0,007). Для снижения уровня АФК происходит активации редуктазной системы, которая может катализировать восстановление трехвалентного железа Fe 3+ до двухвалентного Fe 2+. Очевидно, что для деактивации большего количества АФК эндометриальной клетке требуется большая концентрация редуктаз. Это подтверждается нашими данными: в кистах большего размера отмечалось увеличение «запаса» НАДН-зависимой цитохром b5-редуктазы. Рис. 2. НАДН-активированная хемилюминесценция стенки кисты менее 3 см и более 3 с Однако если сравнить исходный и стимулированный уровень свечения эндометриодной кисты, то оказывается, что в кистах менее 3 см после добавления НАДН уровень активированной хемилюминесценции возрастает в 36 раз, тогда как эндометриомах более 3 см только в 13 раз. То есть несмотря, на казалось бы больший абсолютный уровень IНАДН в эндометриодных кист более 3 см, относительно исходной продукции АФК активность НАДН-зависимой цитохром b5-редуктазы оказывается меньше в сравнении с кистами меньшего размера. Это свидетельствует о недостаточной активности НАДН-зависимой цитохром b5-редуктазы в эндометриомах более 3 см. Антиоксидантная недостаточность в стенке эндометриодной кисты приводит к тому, что свободные радикалы проникают через стенку эндометриодной кисты и могут атаковать здоровую ткань яичника, снижая в ней активность митохондрий. Б) НАДН-активированная хемилюминесценция ткани яичника, окружающей эндометриоидную кисту При сопоставлении НАДН-индуцированной хемилюминесценции ткани яичника и стенки кисты оказалось, что медиана средних значений IНАДН в стенке кисты была выше (IНАДН =2,9 (2,1-4,3) *103 имп/с), чем в ткани яичника (IНАДН =1,8 (1,1-2,7) *103 имп/с), р=0,01 (Рис. 2.13). То есть, казалось бы, фолликулярный аппарат яичника должен быть защищен антиоксидантной защитой, которую обеспечивает стенка кисты. Но следует учитывать, что утечка АФК в митохондриальной цепи в стенке кисты происходит в несколько раз в более значимом объеме по сравнению с тканью яичника. То есть больший «запас» НАДН-зависимой цитохром b5-редуктазы может быть вторичным ответом на избыток АФК в эндометриоме. В связи с этим нами был проведен индивидуальное сопоставление люцигенин-активированной хемилюминесценции (I0) каждого образца ткани яичника с соответствующим образцом кисты (рис. 3). Оказалось, что в кистах менее 3 см отношение I0 кисты/I0 яичника во всех образцах ≤1 (I0=0,03 (0,02-0,05) *103 имп/с). Тогда как в эндометриомах большего размера этот показатель значительно превышал 1 (I0=1,6 (0,5-2,5) *103 имп/с), р=0,0002. То есть в кистах небольшого размера мы наблюдаем баланс АФК по «обе стороны» от стенки кисты, тогда как стенка эндометриомы большего размера продуцирует значительно большие концентрации АФК. Этим дисбалансом и объясняется больший «запас» НАДН-зависимой цитохром b5-редуктазы в эндометриоме по сравнению с тканью яичника. Рис. 3. НАДН-активированная хемилюминесценция стенки кисты и ткани яичника, прилежащей к эндометриодной кисте В) Люцигенин-активированная хемилюминесценция ткани яичника, окружающей доброкачественные неэндометриоидные кисты яичников и ткани «здорового» яичника» При добавлении в среду раствора НАДН была отмечена следующая интенсивность хемилюминесценции в образцах ткани яичника с доброкачественными объемными образованиями: IНАДН = 3,85 (1,54-8,03)в образцах «здоровых» яичников IНАДН =5,8 (1,5-14,6) *103 имп/с. 4. Исследовать хемилюминесцентный ответ ткани яичника при эндометриодных кистах менее и более 3 см. Коэффициент активации рассчитываемый как отношение НАДН-стимулированной хемилюминесценции к люцигенин-активированной хемилюминесценции (КА= IНАДН/I0), для ткани яичника, содержащей кисты менее 3 и более 3 см был различным. Коэффициент активации составил КА= 8,0 (3,-27,8) у пациенток с эндометриомами более 3 см и КА=27,1 (11,9-36,8) при эндометриоме менее 3 см (р = 0,05) (рис. 4). Эти данные также свидетельствуют, что в яичнике с кистой большего размера активность антиоксидантной защиты выражена слабее, что предположительно объясняет более серьезное повреждение овариального резерва при больших эндометриомах. Рис. 4. Хемилюминограммы ткани яичника, содержащие эндометриодные кисты менее и более 3 см. 4. Оценить стимулированную радикал-продуцирующую способность ткани непораженного эндометриозом яичника по сравнению с тканью яичника, содержащего эндометриоидную кисту При добавлении в среду раствора НАДН была отмечена значительно более интенсивная хемилюминесценция в образцах ткани яичника с доброкачественными объемными образованиями, по сравнению с образцами ткани яичника, содержащего эндометриому: IНАДН составила 1,86 (1,1-2,7) в образцах пациенток с эндометриомами и 3,85 (1,54-8,03) в образцах пациенток группы с неэндометриодными образованиями (p = 0,033). Для доброкачественных неэндометриоидных новообразований различного диаметра значимых различий ни в интенсивности НАДН-стимулированной хемилюминесценции, ни в КА, обнаружено не было: IНАДН составила 3,25 (1,46-6,62) против 4,45 (1,54-8,23), КА — 23,41 (7,22-71,13) против 19,25 (8,26-56,18) при образованиях диаметром менее 3 см и более 3 см соответственно. При сравнении интенсивности НАДН-стимулированной хемилюминесценции образцов ткани яичников, содержащих эндометриомы диаметром более 3 см и неэндометриоидные образования диаметром более 3 см была показана менее интенсивная хемилюминесценция при эндометриомах: 1,79 (1,09-2,55) против 4,45 (1,54-8,23) соответственно (p = 0,04). Более того, менее интенсивная НАДН-стимулированная хемилюминесценция была зарегистрирована также при эндометриомах размером менее 3 см по сравнению с крупными неэндометриоидными образованиями (более 3 см): 1,52 (1,25-1,93) против 4,45 (1,54-8,23) соответственно (p = 0,05). То есть хемилюминесцентный ответ ткани яичника даже при доброкачественных новообразованиях большого диаметра был значительно более интенсивным, чем при эндометриомах небольших размеров. Соответственно, можно предположить, что роль механического фактора (более выраженное растяжение яичниковой ткани образованием большего объема) в морфофункциональных изменениях, наблюдаемых в яичнике, содержащем эндометриому, представляется существенно менее значимой, чем роль оксидативного повреждения, поскольку с ростом эндометриоидной кисты увеличивается количество ее содержимого и площадь внутренней поверхности кисты, через которую АФК диффундируют из эндометриоидного содержимого в окружающие ткани, что может дополнительно облегчаться отсутствием у эндометриоидной кисты истинной капсулы. 5. Изучить связь между уровнем АМГ, СА-125 и радикал-продуцирующей способностью ткани яичника Для изучения связи между уровнем АМГ и активностью НАДН-зависимой цитохром b5-редуктазы при двустороннем поражении яичников рассчитывался средний коэффициент активации правого и левого яичников/эндометриом. Была выявлена сильная прямая корреляция (коэффициент корреляции Спирмена 0,59, p = 0,03) между коэффициентом активации ткани яичника и уровнем АМГ (рис. 5), т.е. у пациенток с низким овариальным резервом активность НАДН-зависимой цитохром b5-редуктазы ткани яичника была ниже. При этом у части пациенток с эндометриоидными кистами было обнаружено снижение коэффициента активации даже при нормальном уровне АМГ. Соответственно, при наличии эндометриоза даже при сохранном овариальном резерве (АМГ≥1,1 нг/мл) уже происходит угнетение антиоксидантной защиты и повреждение ткани яичника, еще до хирургического лечения. Молекулярные нарушения, в частности дисбаланс в экспрессии мкРНК, развиваются в тканях кисты еще при нормальном овариальном резерве, что может способствовать прогрессированию патологического процесса, развитие которого усиливает токсическое действие на ткань яичника. Рис. 5. Корреляция между коэффициентом активации ткани яичника и уровнем АМГ. КА= IНАДН/I0. Повышение уровня СА-125 было отмечено у 10 пациенток (максимальное значение составило 192 ед/мл), у остальных пациенток уровень СА-125 оставался в пределах нормы. Коэффициент активации ткани яичника, содержащего эндометриоидную кисту (при двустороннем поражении — среднее значение) слабо обратно коррелировал с уровнем СА-125 (рис. 6). Коэффициент корреляции Спирмена составил -0,4 (р = 0,04). Т.е. при бо́льшей активности эндометриоза наблюдалось более значимое снижение антиоксидантной защиты. Аналогичные данные были получены и на первом этапе нашего исследования: СА-125 может быть использован в качестве маркера эндометриоза. Причины повышения уровня СА-125 при среднетяжелом и тяжелом эндометриозе неизвестны. Согласно одной из гипотез, эндометриоидной тканью продуцируется больше СА-125, чем нормальным эндометрием. Рис.6. Корреляция между коэффициентом активации ткани яичника уровнем СА-125. КА= IНАДН/I0. Таким образом, в ходе данного этапа исследования были получены уникальные данные, показывающие, что для устранения редокс-дисбаланса в эндометриальных клетках стенки эндометриодной кисты, которые подвергались атаке АФК, происходит увеличение «запаса» НАДН-зависимой цитохром b5-редуктазы в стенке эндометриодной кисты, однако ее активность остается недостаточной для свободных радикалов. Исчерпание резервов антиоксидантной защиты, по-видимому, приводит к проникновению АФК через стенку эндометриодной кисты и атаке здоровой ткани яичника, тем самым запуская цитохром с активированную гибель митохондрий в микроокружении эндометриодной кисты яичника, вызывающую апоптоз и возникновение фиброза и как следствие снижение овариального резерва. Все эти изменения в большей степени выражены в кистах более 3 см. Список литературы: А.А. Джатдоева, А.М. Полимова, Е.В. Проскурнина, Ю.А. Владимиров. Тканевая хемилюминесценция как метод оценки супероксид радикал-продуцирующей способности митохондрий. Вестник РГМУ, 2016. №1. С.54-60. Матвеева Н.С., Любицкий О.Б., Осипов А.Н., Владимиров Ю.А. Активированная люцигенином хемилюминесценция тканей животных // Биофизика. – 2007. – T. 6, №1120. – C.1127. И.А. Щепеткин, P.P. Ахмеджанов, В.Т. Кагия, Влияние производных азолов на люцигенин-зависимую хемилюминесценцию микросом. Биомедицинская химия, 2003. Т.49. №3. С.278-283.
3 8 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Изучение уровня антиоксидантной защиты в сопоставлении с уровнем прооксидантной активности ткани яичника, пораженного эндометриозом. Оценка возможность разработки прогностических критериев снижения овариального резерва у пациенток с эндометриодными кистами
Результаты этапа: Результаты данного этапа представлены в статьях "Оксидативный гомеостаз в ткани яичника у пациенток с объемными образованиями яичников"; "Оксидантно-антиоксидантный профиль фолликулярной жидкости: влияние генеза бесплодия, схемы стимуляции овуляции, препарата для анестезии"; "Редокс-статус у пациенток с эндометриоз-ассоциированным бесплодием". Для определения роли оксидативного стресса в повреждении яичника при эндометриозе разработаны оригинальные методики, позволяющие оценить активность источников радикал-продуцирующих систем и уровня антиоксидантной защиты эндометриоидной кисты и ее окружения. Была проведена комплексная оценка оксидантно-антиоксидантных взаимоотношений в яичнике, содержащем эндометриоидную кисту: изменений антиоксидантного статуса стенки эндометриодной кисты и тканей, прилежащих к ней, а также в перитонеальной жидкости. В ходе исследования установлено, что эндометриоидное содержимое является сильным прооксидантом, на порядок сильнее, чем гемоглобин. Для устранения редокс-дисбаланса в эндометриальных клетках стенки эндометриодной кисты, которые подвергались атаке активных форм кислорода (АФК), происходит увеличение «запаса» НАДН-зависимой цитохром b5-редуктазы в стенке эндометриодной кисты, однако ее активность остается недостаточной для свободных радикалов. Исчерпание резервов антиоксидантной защиты, по-видимому, приводит к проникновению АФК через стенку эндометриодной кисты и атаке здоровой ткани яичника, тем самым запуская цитохром с активированную гибель митохондрий в микроокружении эндометриодной кисты яичника, вызывающую апоптоз и возникновение фиброза и как следствие снижение овариального резерва. Полученные экспериментальные данные коррелирует с традиционными клинико-лабораторными параметрами, применяемыми для оценки овариального резерва, а также активности эндометриоза. Показатели антиоксиаднтной активности ткани яичника, прилежащей к эндометриоидной кисте, могут рассматриваться в качестве прогностического критерия снижения овариального резерва. Причем данные параметры отражают снижение фолликулярного запаса за счет развития оксидативного стресса вокруг эндометриоидной кисты еще до выявления снижения овариального резерва по уровню антимюллерова гормона (АМГ). Для практического здравоохранения важным итогом проведенного исследования является фундаментальное обоснование целесообразности хирургического лечения эндометриоидных кист с целью восстановления репродуктивного потенциала у пациенток с эндометриоз-ассоциированным бесплодием на основании изучения патогенеза нарушений оксидантно-антиоксидантного баланса и выявлении факторов, влияющих на фертильность.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".