Изучение организации митохондриального генома низших эукариот (живые наносистемы)НИР

Mitochondrial genome study of lower eukaryotes

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Изучение организации митохондриального генома низших эукариот (живые наноситемы)
Результаты этапа: 1 направление. Проведена оптимизация метода выделения митохондриальных ДНП из клеток различных групп Euglenozoaq (эвглена, трипаносоматиды насекомых). Показано наличие 9-11 коровых белков в составе нуклеоида. Показано, что в зависимости от условий выращивания культур в нуклеоиде присутствуют дополнительно от 5 до 12 белков. Работы по их идентификации будут продолжены. С учетом полученных результатов предложена модифицированная модель организации митохондриального нуклеоида у одноклеточных эукариот. Подготовлена рукопись для журнала «Вестник Московского Университета» по выделению митохондрий из Эвглены. 2 направление.С использованием разработанной программы сборки миникольцевых ДНК создана база данных первичной структуры индивидуальных миниколец митохондриального генома трипаносоматид. Установленные последовательности нуклеотидов 26 миникольцевых молекул размещены в базе данных GeneBank. Показано, что представители, так называемой, медленно эволюционирующей группы трипаносоматид имеют димерный вариант организации, сохраняя только один ген гидовой РНК. Принята в печать статья «МИНИКОЛЬЦЕВОЙ КИНЕТОПЛАСТНЫЙ ГЕНОМ ИНСЕКТНОЙ ТРИПАНОСОМАТИДЫ Leptomonas pyrrhocorys» (Е.С. Герасимов и др. Биохимия). 3 направление. Для анализа адаптационных перестроек генома низших эукариот в стрессовых условиях были протестированы различные представители отряда Двукрылых (Diptera) (комары - представители рода Aedes и сложного вида Culex pipiens, мухи родов Calliphora и Drosophila, свободноживущие галлицы-мицетофаги Mycodiplosis pucciniae и галлообразующие – Dasineura urticae), отличающиеся по адаптационным стратегиям по отношению к температуре существования. Для дальнейшей амплификации отработана пробоподготовка живого материала, собранного в природных и лабораторных условиях, с получением грубого лизата при разрушением клеток в микроволновой печи (без стандартного выделения препарата ДНК с лизирующим буфером или на колонках). Мелкие личинки и яйца насекомых разрушались целиком. У взрослых насекомых использовали отдельные части тела, богатые мышечной тканью (например, бедро). Методика обеспечивает эффективную амплификацию многокопийных участков генома, например – ядерных рибосомных спейсеров. ITS-спейсеры позволяют уточнять видовую принадлежность, IGS-спейсеры могут быть использованы для анализа соматическтих рекомбинационных перестроек под воздействием теплового шока.Методика отработана в условиях полевого стационара на ЗБС в ходе самостоятельной работы студентов 1-го курса. Работа получила первое место на секции по энтомологии, была доложена студентами на летней конференции студентов. Руководители (Ю.В. Малеева и С.Б. Ивницкий получили премию в конкурсе Подготовка выездной молекулярной лаборатории и разработка нового класса практических задач в условиях полевого стационара Звенигородской биостанции Впервые на Звенигородской биологической станции при проведении самостоятельных работ студентов 1-го курса используются молекулярно-биологические методы на собственной лабораторной базе сотрудников биологического факультета (последние несколько лет большим интересом студентов пользовались задачи с использованием оборудования и при активном участии сотрудников лаборатории полевой генетики ИОГЕН РАН). Разработаны упрощенные методики для экспресс-ПЦР анализа полиморфизма грибов и насекомых - организмов со сложно разрушаемыми полисахаридными клеточными стенками или хитиновым внешним скелетом - с использованием СВЧ-печи. Перед амплификацией многокопийных участков генома вместо стандартной процедуры выделения препаратов ДНК используется быстрое разрушение клеточных стенок и жестких структур экзоскелета при разогреве водосодержащих веществ клеток электромагнитным излучением дециметрового диапазона. Подобраны готовые ПЦР-смеси для минимизации контаминации образцов в полевых условиях.Вопрос о специализации насекомых из этой малоизученной группы по отношению к растениям-хозяевам и развивающимся на них видам-прокормителям ржавчинных грибов до сих пор открыт. Одни авторы считают, что на разных видах ржавчинных грибов обитает один вид - M. рucciniae (например, Мамаев, Кривошеина, 1965). Другие дробят вид в зависимости от гриба-прокормителя, активно используя молекулярные признаки (например, Nelsen, 2013). Задачи данной работы 1) сравнить по рибосомным ITS2-спейсерам личинок галлиц, собранных на массовых видах ржавчинных грибов, развивающихся на разных растениях-хозяевах:. на листьях медуницы, зараженных ржавчинным грибом Puccinia bromina, и листьях крапивы, зараженных ржавчинным грибом Puccinia caricis.Галлицы, взятые с зараженных разными видами Puccinia листьев крапивы и медуницы, имеют одинаковый размер амплифицированных рибосомных ITS2 спейсеров. Ранее в полевых условиях для получения препаратов ДНК насекомых использовали методы выделения и очистки препаратов ДНК на колонках. По нашим данным метод получения грубого лизата клеток с помощью микроволновой печи, использовавшийся ранее в лабораторных условиях для спор грибов, миксомицетов (Ferriera et al, 1996, Goodwin, Lee, 1993; цит. по Попова, 2014), яиц комаров (Попова и др., 2014) и личинок галлиц (Малеева и др., 2015), в условиях полевого стационара также показал свою эффективность для дальнейшей амплификации многокопийных частков генома.В работе использован анализ рибосомных ITS-спейсеров, продемонстрировавший свою эффективность для дифференцирования внутри- и межвидовых форм у высших Двукрылых. Ранее (Малеева и др., 2015) было показано, что по рибосомным ITS2-спейсерам личинки галлиц, собранные на мать-и-мачехе и Крестовнике приречном, зараженных одним и тем же грибом Coleosporium tussilaginis (Pers.) Kleb., не отличаются. Результаты этой работы также свидетельствует в пользу представления о том, что это один и тот же вид галлицы. По материалам исследований данного направления сдана в печать (Зоологический журнал) статья «Морфологическая пластичность личиник комаров Culex pipiens F. Molestus forsk (Diptera, Culicidae) как механизм адаптации к городским местообитаниям», авторы С.Б. Ивницкий, О.В. Попова, Ю.В. Малеева
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Изучение организации митохондриального генома низших эукариот (живые наноситемы)
Результаты этапа: 1.Сформулировать особенности организации мт-генома трипаносоматид, имеющих эндосимбионтов. Проведенный анализ первичной структуры кпДНК трипаносоматид, содержащих эндосимбионтов, показал, что наблюдается значительное уменьшение количества криптогенов в митохондриальных максикольцевых молекулах. В частности, такая тенденция соблюдается для генов у представителей следующих родов: Strigomonas, Kentomonas, Angomonas,Wallacemonas (анализировали гены цитохромоксидазы-3, АТФ-синтазы-6 и NADH дегидрогеназы-7). При этом, часть криптогенов сохраняет свою структуру (panediting). 2.Определить пути альтернативного редактирования первичных транскриптов криптогенна rps12 у трипаносоматид На примере трипаносоматиды Leptomonas pyrhocorris Н10 показано несколько вариантов редактирования криптогена rps12 с участием каскадов гидовых РНК. Предварительные данные опубликованы в журнале Nucleic Acids Research. 3. Разработать метод выделения мт-ДНК через выделение ДНК-белкового комплекса (ДНП) для организмов, у которых мт-геном представлен набором гетерогенных ДНК Отработан вариант выделения ДНП из клеток Euglena gracilis. Статья подана в журнал «Вестник МГУ». 4. Будут разработаны методические подходы для анализа адаптационных перестроек генома низших эукариот в условиях стресса различной природы. Сравнительное исследование структуры области ядерных рибосомных генов показало свою эффективность для анализа адаптационных перестроек генома в стрессовых условиях для различных представителей низших эукариот, отличающихся адаптационными стратегиями по отношению к температурному оптимуму. Продолжающийся многолетний мониторинг молекулярной изменчивости ядерных межгенных рибосомных IGS-1-спейсеров Puccinia graminis позволяет фиксировать стабильное изменение амплификационных спектров в природных изолятах этого ржавчинного гриба, произошедшее после тепловой аномалии 2010 года. Предложеный механизм молекулярной перестройки, опосредованной мобильными элементами - термозависимыми ДНК-транспозонами MuDR, обнаруженными в этой области генома, позволяет объяснить экологическую пластичность фитопатогена и балансировку в динамичной системе “паразит-хозяин”. Материал представлен в виде устного доклада на IV Съезде Микологов России (Москва, 12-14 апреля 2017 г.). Мониторинг молекулярной изменчивости ядерных рибосомных IТS-1-спейсеров отдельных представителей двукрылых на примере кровососущих комаров комплекса Culex pipiens и мицетофильных галлиц Mycodiplosis pucciniae, осуществляемый в комплексе с исследованием их морфологических и биологических особенностей, проводится совместно с кафедрой биологической эволюции и с использованием оборудования лаборатории электронной микроскопии Биологического факультета. Для этих модельных объектов, отличающихся темпами роста, особенностями личиночного развития и отношением к температурному фактору, предложены возможные варианты микроэволюции и видообразования. Материал представлен в материалах III международной конференции «Современные проблемы биологической эволюции» Москва, Государственный Дарвиновский музей, 16 октября 2017 — 20 октября 2017. Отработанный вариант пробоподготовки живого материала, собранного в природных и лабораторных условиях Звенигородской биостанции, с получением грубого лизата при разрушении клеток в микроволновой печи (без стандартного выделения препарата ДНК с лизирующим буфером или на колонках) для дальнейшей амплификации, опубликован в материалах Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2017», Москва, ГК «Космос», 18-20 апреля 2017 года.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Изучение организации митохондриального генома низших эукариот (живые наноситемы)
Результаты этапа: 1. Проанализировать особенности организации миникольцевого мт-генома у трипаносоматид, относящихся к различным филогенетическим группам. Проведенный анализ первичной структуры миникольцевого компонента кинетопластного генома трипаносоматид позволяет сделать следующие заключения: а) Преобладающее количество миникольцевых молекул построены по димерному типу, т.е. имеют две симметрично расположенные консервативные области, по меньшей мере, у представителей инсектных трипаносоматид. Такой же вариант организации обнаружен в кпДНК трипаносом рыб (представители диксенных видов зоофлагеллят). б) У трипаносоматид различной родовой принадлежности варьирует степень консервативности структуры константной области миниколец. в) Миникольца транскрибируются по всей длине молекул. Транскрибируются ли все миникольца ассоциата – этот вопрос требует дальнейшего анализа и, возможно, требует разработки нестандартного подхода. 2. Оценить динамичность организации мт-нуклеоида у модельных трипаносоматид при различных физиологических условиях существования культур. На начальном этапе был проведен анализ морфологических параметров структуры кинетопласта у двух видов трипаносоматид (L.pyrrhocoris и K.sorsogonicus), далеко отстоящих на филогенетическом древе, в различных стрессовых условиях роста клеток. Анализировали разные температурные режимы роста и степень полноценности среды выращивания. Электронно микроскопический анализ, показал значительное варьирование компактности укладки кпДНК в ассоциате, особенно в случае Kentomonas sorsogonicus. Дальнейшие исследования было решено проводить на уровне ДНК:белкового комплекса. Прямое сравнение набора белков, ассоциированных с мт-ДНК показало, что имеются проблемы с качественной очисткой кпДНК. Трудности представляет гарантия качественного избавления от примеси основных ядерных белков. С другой стороны, в настоящее время нет окончательного мнения о том какой (ие) конкретно белок является компактизующим в случае митохондрий трипаносоматид. Кандидатами на эту роль могут выступать 6-7 белков, идентифицированных ранее у разных видов. Мы решили получить все эти белки в индивидуальном виде с использованием генно-инженерной технологии и проанализировать специфичность взаимодействия каждого белка с ДНК. Для этого был проведен анализ структуры ядерного генома (установление структуры генома и анализ правильности его сборки проводился в Остравском университете, Чехия, с нашим участием) и были идентифицированы индивидуальные гены-гомологи KAP 1-6 в геномах двух видов Leptomonas. Далее были сконструированы праймеры и получены ПЦР продукты трех KAP-генов. В настоящее время проводится работа по наработке препаративных количеств индивидуальных белков с целью выяснить специфичность взаимодействия этих белков с кпДНК. 3.Определить специфичность кодирования гидовых РНК у представителей разных филогенетических групп трипаносоматид. Был проведен анализ структуры миниколец и максикольца L. pyrrhocoris H10, в результате потенциальные участки кодирования гидовых РНК (гРНК) были обнаружены практически на всех миникольцевых молекулах. Согласно этим данным, миникольца данного вида кодируют как минимум две гРНК, расположенные в разных частых димерного миникольца. Также были найдены несколько случаев, когда миникольца содержат дополнительные молекулы гРНК, вероятнее всего, альтернативные основному пути. Эти данные, полученные на основании сравнительного анализа структур, несомненно нуждаются в экспериментальном подтверждении. Для этого нами разрабатывается протокол получения и секвенирования гРНК с применением методов NGS. Основной сложностью здесь является нестандартная структура молекул гРНК и биологические особенности их процессинга, которые необходимо учитывать при приготовлении библиотек. Стандартные наборы (например, Illumina TruSeq Small RNA kit) не позволяют использовать материал РНК напрямую, без дополнительной обработки. В связи со сложностью, связанной с разработкой и оптимизацией метода выделения гРНК и приготовления библиотеки, секвенирование гРНК планируется осуществить в 2019 году. 4. Оптимизировать систему гетерологичной экспрессии и условий очистки водорастворимых хлорофилл-связывающих белков, участвующих в защите от окислительного стресса Совместно с сотрудниками лаборатории экологической и эволюционной биохимии Института биохимии имени А.Н. Баха РАН (ФИЦ Биотехнологии РАН) в рамках дипломной работы магистра 2-го курса кафедры молекулярной биологии Ю.Н. Обухова (руководители К.В. Неверо и Ю.В. Малеева) начато изучение растительных водорастворимых хлорофилл-связывающих белков (WSCP, water-soluble chlorophyll protein). На основании результатов поиска гомологов WSCP из представителей семейства Brassicaceae с последующим сравнением их аминокислотной последовательности методом множественного выравнивания в качестве основного объекта исследования выбран белок BoWSCP из капусты (Brassica olerace), а белок LvWSCP из клоповника виргинского (Lepidium virginicum) выбран в качестве дополнительного объекта. В результате трансформации клеток E. coli получены депозитные штаммы XL1Blue с плазмидами, содержащими гены белков BoWSCP и LvWSCP, а также штаммы- продуценты E. coli BL21(DE3), экспрессирующие эти белки. Для получения апобелков BoWSCP и LvWSCP в препаративных количествах оптимизированы условия экспрессии и очистки на колонке с Ni-агарозой. Выход белка BoWSCP составил 10,5 мг на литр жидкой культуры. Разработана одностадийная методика получения in vitro препаративных количеств хлорофилл-белковых комплексов WSCP, основанная на извлечение хлорофила из ПБК тилакоидных мембран апобелками WSCP лизата клеток штамма-продуцента, с последующей очисткой препарата на колонке с Ni-агарозой. Для очистки от примесей посторонних растительных и бактериальных белков предложено дополнить методику термообработкой препаратов ПБК WSCP. Характеристика хлорофилл-белковых комплексов BoWSCP и LvWSCP методами абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии, а также спектроскопии кругового дихроизма подтвердила нативность полученных препаратов. Материал вошел в лекционный курс для магистров кафедр молекулярной биологии и биохимии «Молекулярные механизмы адаптации к стрессовым воздействиям» (авторы А.М. Рубцов, Н.Б. Гусев, Д.С. Карпов, О.Л. Кантидзе, Ю.В. Малеева).
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Изучение организации митохондриального генома низших эукариот (живые наноситемы)
Результаты этапа: 1. Оценка различий в структуре мини- и максикольцевых молекул кпДНК трипаносоматид. На сегодняшний день, несмотря на давнюю историю исследований, обе компоненты митохондриального генома трипаносоматид остаются до конца не изученными. Даже на уровне первичной структуры хорошо изученной можно считать только кодирующую область максикольца. Яркой особенностью максикольцевого генома трипаносоматид является деление максикольца на две структурно-функциональные зоны: кодирующую область и дивергентную область. Дивергентная область состоит из повторов разного типа и крайне слабо изучена. С использованием технологии секвенирования PacBio нам удалось установить структуры максикольца Leptomonas pyrrhocoris и Crithidia expoeki, включая полную последовательность дивергентной области. На сегодняшний день это, по многим тестам, наиболее качественные и полные последовательности всей максикольцевой молекулы. Сравнительный анализ этих структур позволил нам выявить важные особенности структурной организации ДО, описав также общий паттерн ее строения (на основании сравнения с имевшимися фрагментами из ДО других видов). Другим важным вопросом является вопрос о степени вариабельности митохнодриального генома. Мы изучили структуру популяций L eptomonas pyrrhocoris (13 изолятов) и Crithidia bombi/Crithidia expoeki (44 изолята) методом WGS. В результате было показано, что несмотря на общепринятое представление о высокой вариабельности митохондриального генома, степень вариабельности его не постоянна. Так, дивергентная область, действительно оказывается крайне динамичной частью максикольца, претерпевая быстрые и масштабные перестройки. В то время как вариабельность в кодирующей области сильно зависит от вида. Так в популяциях Crithidia из Центральной Европы вариабельность в КО максикольца была даже ниже (в расчете на 1000 п.н.), чем у ядерного генома. В то же время, в популяциях L. pyrrhocoris вариабельность КО максиколец выше, чем у ядерного генома. Более детальный анализ, сделанный для криптогена rps12 максикольца L. pyrrhocoris показал, что несмотря на относительно большое число замен, приходящихся на данный ген, абсолютное большинство из них синонимические. Аналогичная ситуация (предварительный анализ), по-видимому, наблюдается для большинства генов максикольца, указывая на то, что данные гены находятся под давлением отбора. Мы также предприняли попытку установить структуру всех типов миниколец митохондриального генома L. pyrrhocoris H10. Предыдущая попытка завершилась успешной сборкой 17 миниколец. На данном этапе мы существенно расширили количество молекул до 65. По нашим оценкам, текущая сборка миникольцевого генома представляет собой более 90% всех классов миниколец ассоциата. Это принципиальное важное значение для оценки 2. Идентификация и выделение белков, связанных с митохондриальной ДНК трипаносоматид. Установление функций выделенных белков в обеспечении динамики организации нуклеоида и регуляции транскрипции генома. Продолжена работа по выделению индивидуальных белков КАР 1-7 из инсектных трипаносоматид. Ранее нами был получен белок КАР6, который показал способность связываться с кпДНК (бакалаврская работа Д. Афонина). К настоящему времени получены рекомбинантные плазмиды в составе экспрессионных векторов, имеющие в качестве встройки последовательности генов КАР1, КАР6 и КАР7. Получены белковые продукты, которые оцениваются на предмет их способности компактизовать ассоциат митохондриальной ДНК L. pyrhocorrys (изолят Н10).(Бакалаврская работа К. Замятниной). 3. Оптимизация методики самосборки пигмент-белковых комплексов водорастворимых хлорофилл-связывающих белков (WSCP), участвующих в защите от окислительного стресса, и подборка вариантов физико-химической характеристики апобелков и пигмент-белковых комплексов. Совместно с сотрудниками лаборатории экологической и эволюционной биохимии Института биохимии имени А.Н. Баха РАН (ФИЦ Биотехнологии РАН) продолжено изучение растительных водорастворимых хлорофилл-связывающих белков (WSCP, water- soluble chlorophyll protein). В рамках выпускной квалификационной работы бакалавра Г.А. Иванова (руководители К.В. Неверов и Ю.В. Малеева) получен штамм-продуцент E. coli BL21(DE3), экспрессирующий апобелок класса I CaWSCP из мари белой (Chenopodium album). Методами абсорбционной и флуоресцентной микроскопии проводится сравнительный анализ очищенного на колонке с Ni-агарозой белка CaWSCP с белками BoWSCP из капусты (Brassica olerace) и LvWSCP из клоповника виргинского (Lepidium virginicum), полученными в препаративных количествах. Продемонстрирована возможность функционирования тетрамеров BoWSCP и LvWSCP в качестве сенсибилизаторов фотохимических реакций. При этом установлено, что димер хлорофилла в составе WSCP способен вступать как в прямое взаимодействие с донорами электрона, так и участвовать в процессах, опосредованных активными формами кислорода, генерируемыми хлорофиллом в составе белка. Показана зависимость скорости фотокаталитического окисления доноров от типа белка и структуры входящих в его состав хромофоров (Хл "а" или Хл "б").
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Изучение организации митохондриального генома низших эукариот (живые наноситемы)
Результаты этапа: 1. Продолжен анализ структуры популяции миникольцевых ДНК с использованием биоинформатики. Показано, что у колец с димерной формой организации отмечаются специфические особенности первичных структур и можно предполагать, что оба варианта «полуколец» эволюционировали независимо. Смысл и причины этого факта остаются не очень понятными. 2. Продолжена работа по созданию генно-инженерными методами коллекции генов, ассоциированных с кпДНК. К настоящему времени получены 5 генов в виде рекомбинантных плазмид как в клонирующем, так и в экспрессионном вариантах. При клонировании в экспрессионном векторе генов КАР2 и КАР3 возникли определенные проблемы. Возможно, это связано с тем, что клонирование проводится в E. сoli (т.е. в прокариотической системе) продукт экспрессии нарушает метаболизм клетки хозяина и как следствие блокирует рост трансформированных клеток. Для получения препаративных количеств белков КАР2 и КАР 3, очевидно, необходимо искать новые методические подходы. Оценка способности КАРов связываться с кпДНК (сделана для КАР1 и КАР6) показала, что КАР1связывается с однонитевыми матрицами и не взаимодействует с двунитевой ДНК. КАР6, наоборот, не связывается с однонитевыми, но формирует комплекс с двунитевыми фрагментами. При этом, какой-либо субстратной специфичности не показывает. КАР1 проявляет определенное сродство к матрицам, обогащенным А+Т парами. Параллельно проводилась оптимизация метода прямого выделения нативного ассоциата кпДНК из клеток представителей трех родов трипаносоматид, с последующей задачей выделения нативных ДНК-связывающих белков. Предварительная характеристика белков из выделенных препаратов показала значительное обогащение искомыми белками, но для выделения чистых белков требуюся дополнительные процедуры. В отработанном варианте метод может использоваться для оценки динамики отдельных белков в клеточном цикле трипаносоматид 3.В рамках выполнения квалификационной работы бакалавра Г.А. Иванова (руководители К.В. Неверов и Ю.В. Малеева) оптимизирована методика выделения в денатурирующих условиях, рефолдинга и очистки мономеров водорастворимого хлорофиллсвязывающего белка CaWSCP. Для этого белка успешно адаптирован одностадийный протокол рефолдинга на NiNTA-агарозной колонке in vitro. Выполнена самосборка CaWSCP с Хл а в гомогенной среде. Смещение положений основных максимумов поглощения в длинноволновую область указывает на вероятное образование тетрамеров. По предварительным данным, при самосборке CaWSCP с Хл а происходит слабая фотоконверсия под действием дневного освещения, что говорит об образовании нативных комплексов тетрамера CaWSCP. Впервые проведена самосборка CaWSCP с БХл а в гомогенной среде. Смещение основных пиков поглощения указывает на возможное образование тетрамеров. Измерения спектров флуоресценции в полученных после диализа препаратах CaWSCP демонстрируют наличие пигментов в составе сформированных тетрамеров.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".