ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Данная работа включает в себя исследование механизмов и факторов, обеспечивающих пространственную мобильность протоонкогенов, и их роли в возникновении хромосомных транслокаций, ассоциированных с вторичными онкологическими заболеваниями человека, а также изучение белков клеточной адгезии и создание адресующих молекул к клеткам опухолей для медицинского применения.
This work includes the study of the mechanisms and factors that promotes the spatial mobility of proto-oncogenes, and their role in the formation of chromosomal translocations associated with secondary human oncological diseases, as well as the study of cell adhesion proteins and the creation of addressing molecules to tumor cells for medical use.
В результате выполнения работ будут получены новые фундаментальные знания о биологических механизмах механизмов и факторах, обеспечивающих пространственную мобильность протоонкогенов, и о их роли в возникновении хромосомных транслокаций, ассоциированных с вторичными онкологическими заболеваниями человека. Также будут расширены представления о функциях белков клеточной адгезии, их роли в процессах метастазирования злокачественных опухолей, разработаны новые подходы к разработке адресующих молекул к клеткам опухолей для медицинского применения.
Авторами настоящего проекта ранее уже был получен ряд приоритетных результатов по данной тематике. В частности было продемонстрировано, что ген ETO, частый участник лейкозогенных хромосомных транслокаций, изменяет свое пространственное положение в ядре первичных эмбриональных фибробластов человека в условиях ингибирования ДНК-топоизомеразы II этопозидом (Rubtsov et al., 2008). Впоследствии мы поставили перед собой задачу проанализировать перемещение генов AML1 и ETO в трехмерном пространстве ядра. Для этого мы «проследили их судьбу» в культуре клеток Jurkat, клетки в которой имеют правильную округлую форму и практически не различаются по размеру, при этом большую часть объема клетки занимает ядро, которое также имеет правильную шаровидную форму. Благодаря этому клетки Jurkat идеально подходят для приготовления объемных препаратов при проведении трехмерной флюоресцентной гибридизации in situ. Исследование объемных препаратов, в которых сохраняется исходная морфология ядер, позволяет избежать ошибок в определении взаимного расположения объектов в трехмерном пространстве. Мы провели эксперименты, позволяющие одновременно визуализировать положение генов AML1, ETO и ядрышка в пространстве ядра. Применение конфокальной микроскопии с последующей трехмерной реконструкцией изображений дало нам возможность определить взаимное расположение в пространстве ядра изучаемых нами объектов. В результате анализа препаратов выяснилось, что, в случае обработки клеток Jurkat этопозидом, вероятность взаимной колокализации генов AML1 и ETO увеличивается с 2,7 до 7,8% (в 2,9 раза) (Rubtsov et al., 2011)
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Изучение молекулярных основ онкогенеза |
Результаты этапа: По итогам выполнения проекта в 2016 году опубликованы 2 статьи, представлены доклады в рамках 3 международных конференций, исполнителями-студентами защищены 4 дипломных работы. | ||
2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Изучение молекулярных основ онкогенеза |
Результаты этапа: | ||
3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Изучение молекулярных основ онкогенеза |
Результаты этапа: ходе проделанной работы были получены плазмиды, содержащие гены гидовых РНК, для внесения двуцепочечных разрывов в гены MLL и MLLT3. Была проверена возможность внесения двуцепочечных разрывов в гены AML1, ETO, MLL и MLLT3 с помощью системы CRISPR/Cas9. Данные разрывы имели ожидаемую локализацию внутри кластеров точек разрывов, ассоциированных с лейкозогенными транслокациями. Была достигнута главная цель работы: удалось создать клеточную линию LCL_iAML/ETO, в которой после активации доксициклином воспроизводятся двуцепочечные разрывы, приводящие к формированию лейкозогенных транслокаций. Экспрессия Cas9 в этой линии выходит на плато к 24 часам после активации. В то же время первые хромосомные перестройки надежно детектируются с помощью вложенной ПЦР спустя 48 часов с момента активации. Последовательность нуклеотидов в точке транслокации полностью соответствует ожидаемой. Были подобраны условия для определения частоты возникновения хромосомной транслокации AML1-ETO с помощью количественной ПЦР. При работе с полученной модельной линией удается сравнивать влияние ингибиторов белков репарации на частоту транслокаций. Это означает, что полученная линия LCL_iAML/ETO может использоваться для скрининга потенциальных лекарств, снижающих вероятность развития вторичного лейкоза. | ||
4 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Изучение молекулярных основ онкогенеза |
Результаты этапа: Планировалось установить, существует ли отличие в адгезии к белкам внеклеточного матрикса у клеток стабильных линий, экспрессирующих рекомбинантные слитые белки, содержащие в внеклеточном домене различное количество тандемных повторов из области VNTR муцина MUC1 человека. Применялись: анализ клеточной адгезии, проточная цитометрия, конфокальная флуо-ресцентная микроскопия. Результаты: При увеличении числа тандемных повторов в внеклеточной области муцина MUC1 человека сначала равномерное распределение рекомбинантного белка в области контакта клетки со стеклом изменяется на дискретное, а затем происходит формирование компактных кластеров. Адгезия клеток к витронектину и фибронектину не зависит от количества интегриновых рецепторов на клеточной поверхности, уменьшаясь в ряду: HT-29_TR4 → HT-29_TR12. У клеток HT-29_TR20 наблюдается увеличение адгезии к данным белкам внеклеточного матрикса. Интегрин avb3 (рецептор витронектина) кластеризуется в клетках всех проанализированных линий, в то время как интегрин a5b1 (рецептор фибронектина) образует компактные кла стеры только на поверхности клеток HT-29_TR20. Оба интегрина распределены в областях, лишенных молекул MUC1 на поверхности клеток HT-29_TR4, HT-29_TR12 и HT-29_TR20, а распределение данных интегринов на поверхности клеток HT-29_TR- не зависит от локализации рекомбинантного белка. Увеличение числа тандемных повторов в экстрацеллюлярной области муцина MUC1 от 12 до 20 приводит к заметному ослаблению антагонизма муцина MUC1 по отношению к интегрину avb3 при адгезии клеток к витронектину и появлению синергизма по отношению к интегрину a5b1 при адгезии клеток к фибронектину. | ||
5 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Изучение молекулярных основ онкогенеза |
Результаты этапа: Отработана методика перевода культуры из 3D в 2D, методика подготовки образцов для анализа содержания интегриновых рецепторов в зависимости от продолжительности культивирования. Проведен анализ способности к адгезии к различным белкам внеклеточного матрикса у клеток, выращенных в монослое и в виде сфероидов. Получены сублиний клеточных линий DU145, PC-3, MDA-MB231 и HT-29 методом клональной селекции. Оценена их способность к адгезии к различным белкам вреклеточного матрикса. Проведена оценка и сравнение содержания интегриновых рецепторов в клетках сублиний. Проведено параллельное 2D и 3D культивирование полученных сублиний, подготовлены образцы для оценки и сравнения содержания интегриновых рецепторов. Проанализирована способность к адгезии к различным белкам внеклеточного матрикса у клеток, выращенных в монослое и в виде сфероидов. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".