ИСТИНА

В последние годы не прекращаются случаи применения высокотоксичных веществ в ходе террористических актов и локальных военных конфликтов. Сохраняется реальная угроза распространения химического и токсинного оружия. Объективное расследование фактов, связанных с обращением высокотоксичных соединений, сопряжено с трудностями, обусловленными отсутствием надежных способов выявления следовых количеств этих веществ в объектах окружающей среды, в технологических средах и в биообъектах. Актуальность проекта определяется необходимостью формирования новых научно-методических подходов к созданию способов и методик идентификации и определения в сложных матрицах маркеров и метаболитов отравляющих веществ и биотоксинов, обеспечивающих их выявление и расследование инцидентов с применением высокотоксичных соединений для поражения людей, животных и растений. Решение данной проблемы находится в сфере обеспечения химической безопасности Российской Федерации. Научная новизна ожидаемых результатов, полученных в ходе выполнения проекта, заключается в создании новых способов выявления маркеров и метаболитов отравляющих веществ и биотоксинов в различных средах с использованием последних модификаций методов хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования следовых количеств токсикантов и их маркеров. По результатам выполнения проекта планируется подготовить ряд публикаций в ведущих индексируемых изданиях, в которых будут изложены новые подходы к созданию методик идентификации и определения в сложных матрицах следовых количеств маркеров и метаболитов отравляющих веществ и биотоксинов. Реализация разработанных подходов планируется в виде пакета методик и операционных процедур, обеспечивающих эффективное решение указанной задачи. Общественная значимость ожидаемых результатов заключается в предполагаемом использовании созданного в рамках проекта методического аппарата для обеспечения контроля за нераспространением химического и токсинного оружия и в его вкладе в обеспечение химической безопасности страны.

In recent years, there are a lot of cases of using highly toxic substances during terrorist attacks and local military conflicts. Nowadays there is a real threat of spreading chemical and toxin weapons. An objective investigation of the facts connected with the manipulation of highly toxic compounds is associated with difficulties due to the lack of reliable methods for detecting trace amounts of these substances in environmental objects, in technological environments and in biological samples. The relevance of the project is determined by the necessity of forming new scientific and methodological approaches to the creation of methods and techniques for identifying and determination of markers and metabolites of chemical warfare agents (CWA) and biotoxins in complex matrices that ensure their detection and investigation of incidents with the use of highly toxic compounds for the destruction of people, animals and plants. The solution of this problem is in the sphere of ensuring chemical safety of the Russian Federation. Scientific novelty of the expected results, which will be obtained during implementation of the project is in creation of new ways for identification of markers and metabolites of CWA and biotoxins in various media using the latest modifications of chromatographic separation and mass spectrometric detection methods. It is planned to patent a number of developed techniques. Based on the results of the project, it is planned to prepare a number of publications in the leading journals, in which new approaches to the development of techniques for identification and determination of trace amounts of markers and metabolites of CWA and biotoxins in complex matrices will be described. Implementation of the developed approaches is planned in the form of a package of methodologies and operational procedures that ensure the effective solution of this task. The public significance of the expected results is in the intended use of the methodological apparatus created to control the non-proliferation of chemical and toxin weapons and in its contribution to ensuring chemical safety of the country.

На основе полученных в ходе реализации проекта данных ожидается: - расширение области знаний о процессах формирования вторичных метаболитов ОВ, а также долгоживущих маркеров и аддуктов с биомакромолекулами. Выявление маркеров, пригодных для ретроспективного отслеживания применения известных видов ОВ; - создание схем пробоподготовки для образцов биопроб и объектов окружающей среды, обеспечивающих удовлетворительные коэффициенты извлечения целевых соединений одновременно с эффективной очисткой от мешающего влияния матричных компонентов; - создание и экспериментальная апробация новых подходов целевого анализа биомаркеров отравляющих и токсичных веществ на уровне следовых количеств с пределами детектирования на уровне 0.1-10 нг/мл; - совершенствование разработанных способов при исследовании процессов деградации и трансформации ОВ в окружающей среде и живых организмах для поиска оптимальных условий достоверного, чувствительного и ретроспективного обнаружения выявленных биомаркеров; - экспериментальная апробация разработанных научно-методических подходов в т.ч. при их внедрении в работу аккредитованной российской лаборатории при участии в официальных профессиональных тестах ОЗХО; - создание алгоритма обнаружения маркеров рицина и других биотоксинов (абрина, сакситоксина и др.) в растительных экстрактах и биопробах.

В 2015 - 2017 на базе Костромского государственного университета был успешно реализован проект РНФ 15-13-10005 "Исследование закономерностей формирования масс-спектров электронной, химической и электрораспылительной ионизации маркеров отравляющих веществ в целях методического обеспечения определения их в объектах окружающей среды и в биологических средах". В рамках данного проекта были установлены закономерности формирования масс-спектров для большого числа значимых продуктов трансформации отравляющих веществ, предложены основные методологические подходы, использование которых позволяет проводить контроль содержания данных веществ в различных объектах. Показано, что использование масс-спектрометрических методов позволяет достигать низких пределов обнаружения. При этом, установлено, что для создания наиболее эффективных и чувствительных способов анализа продуктов трансформации отравляющих веществ наиболее перспективным является вариант хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения, как наиболее прогрессивный современный вариант масс-спектрометрии.

В результате работы был разработан простой, чувствительный и надежный способ определения пяти маркеров применения нервно-паралитических отравляющих веществ (НПОВ) в образцах растительного происхождения с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения (ВЭЖХ-МСВР). В качестве модельного растении был выбран кресс-салат (Lepidium sativum). Хроматографическое разделение метилфосфоновой кислоты (МФК) и четырех алкилметилфосфоновых кислот (АМФК) проводили на обращенно-фазовой колонке с полярным эндкеппингом (Aqua C18 column, 250 × 4.6 мм, 5 μm, Phenomenex, Германия), что позволило достичь высоких значений факторов удерживания аналитов и минимизировало влияние матричных компонентов пробы на их аналитический сигнал. В качестве подвижной фазы использовали смесь 0.1% муравьиной кислоты (А) и ацетонитрила (Б). Было применено градиентное элюирование. В течение 1.6 мин через систему прокачивали 100% растворителя А. В дальнейшем содержание растворителя Б увеличивали до 30% в течение 6.4 мин и за 0.1 мин до 95% Б. Далее выбранный состав растворителей прокачивали через систему в течение 5 минут. Возвращение к первоначальным условиям проводили за 0.9 минут и уравновешивали колонку перед следующим вводом пробы в течение 5 мин. Общее время анализа 19 мин. Скорость потока составила 1.3 мл/мин, колонку термостатировали при 40 ºС, объем вводимой пробы составил 10 мкл. Чувствительное и надежное определение МФК и АМФК проводили при помощи гибридного квадруполь/времяпролетного масс-спектрометра высокого разрешения. Детектирование аналитов проводили в режиме сканирования отрицательно заряженных ионов по точным массам их депротонированных молекул: [M-H]- ионы с m/z 94.9904, 123.0217, 137.0373, 151.0530 и 179.0843 для МФК, этилметилфосфоновой кислоты, изопроилметилфосфоновой кислоты, изобутилметилфосфоновой кислоты и пинаколилметилфосфоновой кислоты. До проведения анализа растительных экстрактов была проведена тщательная валидация разработанного способа по следующим параметрам: линейность градуировочной зависимости, предел обнаружения, наименьшая определяемая концентрация, точность, воспроизводимость и матричный эффект. Пределы обнаружения определяемых соединений находились в диапазоне от 1 до 30 нг/мл. Градуировочные графики были линейны в диапазоне от 50 до 2000 нг/мл. Для всех зависимостей были получены высокие значения коэффициентов корреляции от 0.996 до 0.999. Остальные параметры имели приемлемые значения, необходимые для успешного применения разработанного способа к реальным образцам. Благодаря гидропонному выращиванию кресс-салата удалось заменить питательную среду растения с загрязненной маркерами отравляющих веществ на чистую воду, что позволило надежно изучить процесс накопления маркеров НПОВ в различных частях растения (корни, листья). В результате было обнаружено, что кресс-салат способен накапливать маркеры ОВ в течение 5 недель, предотвращая гидролиз АМФК до МФК, который быстро протекает в почвах и природных водах. Данный факт позволяет проводить детектирование МФК и АМФК с высокой ретроспективностью, а также устанавливать тип и происхождение примененного НПОВ. При разработке усовершенствованных процедур подготовки экспонированной циклогексилметилфторфосфонатом плазмы крови человека, условий ВЭЖХ-анализа, а также в выборе и исследовании масс-спектральных характеристик образующихся аддуктов выбраны три основных биомаркера применения циклогексиметилфторфосфоната – фосфорилированный нонапептид – аддукт циклогексиметилфосфоната с бутирилхолинэстеразой (АБХЭ), альбуминовый аддукт циклогексиметилфосфоната с тирозином (ТАЦЗ) и циклогексилметилфосфоновая кислота (ЦГМФК). При исследовании масс-спектрометрических характеристик выбранных метаболитов использовали режим регистрации положительных (для АБХЭ и ТАЦЗ, поскольку в составе имеются аминогруппы) и отрицательных ионов (для ЦГМФК, так как данное соединение обладает ярко выраженными кислотными свойствами). В масс-спектрах АБХЭ, ТАЦЗ и ЦГМФК наблюдали интенсивные пики ионов с m/z 956.41, 342.15 и 177.07, соответственно, поэтому при выборе оптимальных ионных реакций для их детектирования исследовали их фрагментацию в режиме высокого разрешения. Установлено, что наибольший аналитический сигнал достигается при использовании следующих пар ионных реакций: в случае ЦГМФК – m/z 177.07 → m/z 94.9904 и m/z 177.07 → m/z 76.9798, в случае АБХЭ – m/z 956.41 → m/z 778.3366 и m/z 956.41 → m/z 673.2940, в случае ТАЦЗ – m/z 342.15 → m/z 260.0682 и m/z 342.15 → m/z 214.0628. Для каждого фрагментного иона установлена брутто-формула. Первая ионная реакция использовалась для количественной оценки содержания циклогексиметилфосфоната, вторая – для достоверного подтверждения. Для каждой ионной реакции выбрана оптимальная энергия фрагментации, позволяющая достигать наибольший аналитический сигнал. При исследованиях величина разрешения масс-анализатора составляла не менее 30000, погрешность при определении величины m/z не превышала 2 млн-1. В ходе разделения использовали вариант обращенно-фазовой хроматографии (колонка Thermo Acclaim 120 C18 (250 мм x 2.1 мм), диаметр зерна сорбента 3 мкм). Исследуемые три метаболита циклогексилметилфторфосфоната обладают кислотными свойствами, поэтому для увеличения доли незаряженных частиц данных веществ и уменьшения размывания хроматографических пиков использовали подвижную фазу, состоящую из 0.1%-ного раствора муравьиной кислоты в воде и 0.1%-ного раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле. В случае детектирования АБХЭ и ТАЦЗ присутствие муравьиной кислоты в подвижной фазе также способствовало увеличению доли положительно заряженных ионов в камере ионизации за счет протонирования аминогрупп данных биомаркеров. В выбранных условиях разделения коэффициенты емкости для АБХЭ, ТАЦЗ и ЦГМФК составили 5.8, 5.1 и 4.5, соответственно, что обеспечивает экспрессность их разделения. В данных условиях эффективность хроматографической колонки характеризуется большим числом теоретических тарелок – более 110 000 на метр. При усовершенствовании условий пробоподготовки при выделении выбранных биомаркеров использовали ранее описанные подходы – [1] для АБХЭ и ТАЦЗ, [2] для ЦГМФК. В нашей работе впервые показано выделение АБХЭ из плазмы крови человека, экспонированной циклогексилметилфторфосфонатом. При выделении ТАЦЗ нами удалось в 1,5 раза сократить стадию пробоподготовки за счет исключения этапа трипсинолиза. При обнаружении ЦГМФК для увеличения аналитического сигнала варьировали объем аликвоты в диапазоне 50 –300 мкл. Оказалось, что при использовании аликвоты плазмы более 200 мкл аналитический сигнал ЦГМФК не увеличивается, при этом увеличивается влияние матрицы на ионизацию аналита (при объеме аликвоты 200 мкл величина матричного эффекта составляет (93±7)%, при 250 мкл – (70±10)%, при 300 мкл – (60±10)%). При оценке метрологических характеристик построены градуировочные зависимости площади пика каждого из трех биомаркера в зависимости от содержания циклогексиметилфосфоната в диапазоне концентраций 0.05 – 8 нг/мл. Диапазон линейности в случае определения ЦГМФК и АБХЭ составил 0.2 – 8 нг/мл, в случае ТАЦЗ – 0.1 – 8 нг/мл. Коэффициенты корреляции во всех случаях были более 0.995. Также для улучшения аналитических характеристик при определении АФК и АМФК была применена дериватизация, так как данные соединения являются полярными и имеют невысокие молекулярные массы, что затрудняет их чувствительное ВЭЖХ-МС определение в условиях обращено-фазовой хроматографии. Для проведения реакции дериватизации смеси кислот в качестве реагента предложен п-метоксифенацилбромид (ПМФБ). Реакция протекает по механизму нуклеофильного замещения, поэтому в случае алкилфосфоновых кислот, помимо продукта по одной OH-группе, образуются также продукты по двум OH - группам. На основе интерпретации масс-спектров первого и второго порядка выбраны характеристичные переходы, позволяющие проводить чувствительное определение в режиме мониторинга выбранных реакций. Показано, что в режиме регистрации отрицательно заряженных ионов производные АМФК не ионизируются, поэтому в данном режиме возможно определение только АФК. Однако в режиме регистрации положительно заряженных ионов возможно детектировать продукты по одной и по двум группам, как следствие, возможно одновременное определение сразу всех кислот. Подобраны условия хроматографического разделения в режиме обращенно-фазовой хроматографии. Установлено, что в режиме гидрофильной хроматографии АМФК не разделяются и имеют низкие значения факторов удерживания. Показано, что реакция дериватизации протекает только в присутствии оснований: NaHCO3, K2CO3 или Et3N. Наиболее подходящим основанием являлся Et3N с концентрацией в среде реакции 90 мкг/мл. Оптимизированы условия проведения реакции. Установлено, что присутствие воды в реакционной смеси уже в количестве 10% заметно снижает выход реакции, что сказывается на метрологических характеристиках данного метода.