| 1 |
31 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. |
Механизм регуляции Интегрального антистрессового ответа опухолевым супрессором р53 |
| Результаты этапа: Ранее мы изучали индукцию антистрессового ответа при ингибировании дыхательной цепи митохондрий миксотиазолом и обнаружили, что при активации опухолевого супрессора р53 происходит подавление ATF4-зависимой транскрипции (ранний ответ) и переключение на более позднюю р53-регулируемую транскрипцию. На данном этапе проекта выполнялись исследования, направленные на то, чтобы выяснить, насколько общим является негативное действие р53 на ATF4-зависимую транскрипцию. Методом ОТ-ПЦР в реальном времени мы исследовали влияние разных способов активации р53 на неиндуцированную транскрипцию мРНК ATF4 и его генов-мишеней и на индуцированную ATF4-зависимую транскрипцию, вызванную разными индукторами ISR. Мы показали, что разные способы активации эндогенного р53 (обработка доксорубицином, 5-фторурацилом, нутлином 3) подавляют неиндуцированную транскрипцию мРНК ATF4 и его гена-мишени SLC7A11 и ATF4-зависимую транскрипцию, индуцированную ингибиторами I и III комплекса дыхательной цепи митохондрий пирицидином А и миксотиазолом. Обработка доксорубицином и нутлином 3 подавляла также активацию транскрипции мРНК ATF4 и его генов-мишеней при стрессе эндоплазматического ретикулума, вызванном туникамицином. Таким образом, мы показали, что репрессия ATF4-зависимой транскрипции под действием р53 это достаточно общее явление, которое наблюдается при разных способах активации р53 и различных видах интегрального антистрессового ответа. Для изучения механизма негативного влияния р53 на ATF4-зависимую транскрипцию был сконструирован репортер на основе плазмиды pGL4, в котором ген люциферазы светлячков находится под контролем полноразмерного промотора ATF4 и 5’-нетранслируемой области (5’-NTR) кДНК ATF4 человека. Были подобраны условия, при которых индукторы ISR индуцируют нормированную экспрессию репортерного гена, а активаторы р53 ее подавляют. Было показано, что совместная обработка доксорубицином и индукторами ISR в существенной степени предотвращает активацию репортера. Полученная нами репортерная конструкция будет использована на последующих этапах работы для картирования участка ДНК, ответственного за регуляцию транскрипции гена ATF4 при активации р53 методами точечного и делеционного мутагенеза. |
| 2 |
1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. |
Механизм регуляции Интегрального антистрессового ответа опухолевым супрессором р53 |
| Результаты этапа: активации эндогенного p53 приводят к подавлению базальной транскрипции гена ATF4 и ATF4-зависимой транскрипции, индуцированной при активации интегрального антистрессового ответа. На данном этапе работы проводилась проверка гипотезы об участии сигнального пути пути р53-р21-DREAM в ингибировании ATF4-зависимой транскрипции при активации р53. Для оценки роли p53 и р21 мы использовали нокаутные по p53 и р21 клеточные линии HCT116 p53-/- и HCT116 p21-/-. Методом ОТ-ПЦР в реальном времени мы показали, что подавление активированной митохондриальной дисфункцией транскрипции гена ATF4 и его генов-мишеней (CHOP, SLC7A11, ASNS, CAT-1, CHAC1 ,TRIB3) при обработке клеток 5-фторурацилом и Нутлином-3а в существенной степени отменялось в отсутствие р53. Отмена подавления индуцированной экспрессии ATF4 в клетках HCT116 p53-/- при обработке 5-фторурацилом была показана также на уровне белка методом иммуноблоттинга. Для оценки роли р21 мы использовали нокаутную по р21 клеточную линию HCT116 p21-/-. Методом ОТ-ПЦР в реальном времени было показано, что активация р53 5-фторурацилом в этих клетках также в существенно меньшей степени предотвращала индукцию транскрипции мРНК ATF4 и его генов мишеней CHOP, SLC7A11, ASNS, CAT-1, CHAC1 и TRIB3 при ингибировании первого комплекса ДЦМ пирицидином А, чем это наблюдалось в клетках дикого типа HCT116 wt. Полученные нами данные подтверждают важную роль активации сигнального пути p53/p21 в подавлении интегрального антистрессового ответа клетки. Далее нами была изучена роль потенциального СНR-элемента (ответственного за связывание комплекса DREAM) в 5’-NTR ATF4 в подавлении транскрипции, зависимой от промотора ATF4 , посредством р53. Для этого мы инактивировали СНR-элемент в репортерной конструкции pGL4.10-ATF4, созданной нами в 2018 году, методом сайт-направленного мутагенеза. Исходной репортерной плазмидой и репортерной плазмидой с инактивированным СНR–элементом мы трансфицировали культивируемые клетки человека и проанализировали влияние активации р53 под действием доксорубицина и 5-фторурацила на активность репортерного гена luc и на уровень транскрипции репортерного гена в клетках HCT116. Мы показали, что мутагенез СНR-элемента не предотвратил негативную регуляцию репортерного гена при активации р53. Таким образом на данном этапе работы гипотезу об участии сигнального пути p53-p21-DREAM в ингибировании транскрипции гена ATF4 при активации p53 не удалось подтвердить. Мы предполагаем, что скорее всего, в это явление вовлечены другие p53/р21-зависимые сигнальные каскады. Далее мы перешли к делеционному анализу промоторной области репортера с целью картирования участка, ответственного за негативную регуляцию экспрессии гена ATF4. Оказалось, что репортеры, содержащие укороченные фрагменты промоторной области ATF4, начинающиеся с нуклеотидов -1200, -900 и -460 относительно старта транскрипции, ведут себя аналогично репортеру с полноразмерной промоторной областью (2500 п.о.) в тесте на активность репортерного гена при действии доксорубицина и 5-фторурацила. В следующем году мы продолжим систематическое исследование регуляторных участков ATF4 в составе полученной нами репортерной плазмиды методами делеционного и точечного мутагенеза с целью выявление участка, ответственного за подавление промотора ATF4 при активации р53 и идентификации транскрипционного фактора, который может опосредовать эту регуляцию. |
| 3 |
1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. |
Механизм регуляции Интегрального антистрессового ответа опухолевым супрессором р53 |
| Результаты этапа: В 2020 г. был получен репортер, в котором с помощью делеции был удален сайт связывания транскрипционного фактора Nrf2 ARE. Было показано, что репортер, не содержащий сайта ARE, не активировался при эктопической экспрессии Nrf2,в то же время его активность в меньшей степени ингибировалась при обработке 5-фторурацилом для индукции р53, чем активность репортера с сайтом ARE. Эти данные указывают на то, что транскрипционный фактор Nrf2 может принимать участие в негативной регуляции транскрипции гена ATF4 при активации р53.
Мы показали, что повышение уровней транскриптов ATF4 и его генов- мишеней Slc7A11, ASNS и генов ферментов биосинтеза серина PSAT1 и PHGDH при продолжительной обработке пирицидином А отменяется ингибитором mTORC1 торином1, в то время как активация ATF4-зависимой транскрипции под действием индуктора стресса ЭР брефельдина А нечувствительна к торину 1. Эти данные указывают на то, mTORC1 является важным upstream регулятором опосредованного ATF4 транскрипционного антистрессового ответа, индуцированного ингибированием I комплекса ДЦМ пирицидином А. В ходе выполнения проекта нами были получены данные, подтверждающие важную роль активации сигнального пути p53/p21 и сигнального пути p53/mTORC1 в негативной регуляции ATF4-зависимой транскрипции, индуцированной ингибированием ДЦМ. |
