ИСТИНА

Связь между нарушениями в составе компонентов внеклеточного матрикса и возникновением и развитием различных патологий показана для многих заболеваний, однако данный механизм мало исследован в контексте нейровоспалительных состояний центральной нервной системы. Данный проект сфокусирован на проблеме установления взаимосвязи астроцитов - глиальных клеток, активно вовлеченных в воспалительные ответы центральной нервной системы, и системы метаболизма гиалуроновой кислоты (гиалуронана), которая относится к ключевым компонентам внеклеточного матрикса ЦНС и считается эндогенным лигандом, активирующим внутриклеточные сигнальные каскады посредством взаимодействия с рядом рецепторов, среди которых толл-подобные рецепторы (ТЛР2, ТЛР4) и рецепторы CD44. Авторами проекта выдвинута гипотеза, что важным компонентом такой взаимосвязи является циклооксигеназный путь, который включает в себя внутриклеточную трансформацию полиненасыщенных жирных кислот в сигнальные липиды. Актуальность предлагаемого исследования определяется важностью управления воспалительными процессами мозга, поскольку нейровоспаление сопровождает большинство известных патологий ЦНС: нейродегенеративные заболевания (болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона); рассеянный склероз; травматические повреждения (в том числе, вследствие ишемических инсультов). Понимание молекулярных механизмов процессов нейровоспаления позволит понять механизмы развития указанных патологий, разработать терапевтические подходы для коррекции и направленной регуляции состояний. В данном проекте поставлены следующие задачи: 1) охарактеризовать действие провоспалительных стимулов на синтез гиалуроновой кислоты астроглиальными клетками; 2) охарактеризовать участие низкомолекулярных и высокомолекулярных форм гиалуроновой кислоты в регуляции воспалительного ответа астроглиальных клеток. В проекте будут использованы как классические методы клеточной и молекулярной биологии, которые были результативно использованы руководителем проекта на предыдущих этапах исследований астроцитов, так и оригинальные подходы, связанные с клеточными моделями острого, подострого и хронического воздействия экзогенных стимулов толл-подобных рецепторов и накопленного экспериментального материала на предварительных этапах исследований, связанных с характеристикой воспалительных ответов на астроцитах. Предлагаемые подходы и методы являются актуальными, современными и востребованными. В рамках выполнения работ по задаче 1 будут получены первичные культуры астроглиальных клеток по отработанным ранее автором методикам. Методами иммуноцитохимии будет проанализировано соотношение клеток в смешанной культуре с использованием маркеров: GFAP (астроциты), CD11b (микроглия), DAPI (ядра). Клетки будут подвергнуты обработкам агонистами ТЛР4 (липополисахарид, ЛПС) и ТЛР3 (poly IC, PIC) рецепторов. Оценен уровень экспрессии ферментов синтеза гиалуроновой кислоты (HAS1, HAS2, HAS3, UDP-глюкуронозилтрансферазы) методами ПЦР в режиме реального времени и иммунноблоттинга. Изменения в уровнях синтеза гиалуроновой кислоты в астроглиальных клетках, подвергнутых провоспалительным стимуляциям, будут определены иммуноферментным анализом, а также посредством иммуноцитохимического маркрования клеточных культур антителами против GFAP и меченным белком HABP. Для выявления механизмов, ответственных за регуляцию медиаторов синтеза гиалуроновой кислоты будет проанализировано влияние ингибиторов каскадов митоген активируемых белковых киназ и фактора транскрипции (SP600125 для JNK; SB 203580 для р38; Bay 11-7082 для комплекса NF-кВ) на уровень экспрессии ферментов. Будет проверено влияние 4-метилумбелиферона и аспирина на синтез гиалуроновой кислоты астроцитами. По задаче 2 клеточные культуры будут подвергнуты обработке высокомолекулярной (MW>500 кДа) и низкомолекулярной (MW 10-500 кДа) гиалуроновой кислотой в самостоятельном режиме обработки или в комбинации с агонистами ТЛР3 (Poly IC) или ТЛР4 (ЛПС). Методами иммунноблоттинга или иммунноферментного анализа будут проанализированы изменения в экспрессии маркеров про- и антивоспалительного ответа астроглиальных клеток, подвергнутых обработкам высоко- и низкомолекулярной гиалуроновой кислотой: IL-12, IL-1beta, IL-10, TNFalpha, COX-1, COX-2, iNOS, аргиназы 1, а также определены изменения в профиле высвобождения PGE2, PGD2, 15d-PGJ2, PGA2, TXB2 и др. В результате выполнения предлагаемого проекта будут получены данные о взаимосвязи гиалуроновой кислоты с воспалительными ответами астроглиальных клеток, проверена гипотеза о вовлечении циклооксигеназного пути синтеза сигнальных липидов в исследуемую взаимосвязь, оценена возможность управления этими взаимосвязями посредством добавления низкомолекулярных ингибиторов, в том числе лекарственных препаратов.

Connections between alteration of extracellular matrix composition and the emergence and development of various pathologies has been detected for many diseases, but the mechanisms of these alterations has been poorly studied in the context of inflammatory states of the central nervous system. This project is focused on the problem of relationships between astrocytes - glial cells, actively involved into inflammatory responses of the central nervous system, and the hyaluronic acid (hyaluronan) metabolism system, which is a key component of the extracellular matrix of the CNS and is considered an endogenous ligand that activates intracellular signaling cascades through interaction with a number of receptors, among which are TLL-like receptors (TLR2, TLR4) and CD44 receptors. The authors of the project put forward the hypothesis that an important component of this relationship is the cyclooxygenase pathway, which includes intracellular transformation of polyunsaturated fatty acids into signal lipids. The relevance of the proposed study is determined by the importance of controlling the inflammatory processes of the brain, since neuroinflammation accompanies most known pathologies of the central nervous system: neurodegenerative diseases (Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's); multiple sclerosis; traumatic injuries (including, due to ischemic strokes). Understanding the molecular mechanisms of neuroinflammation processes will enable us to understand the mechanisms of development of these pathologies, to develop therapeutic approaches for correction and directed regulation of states. In this project, the following tasks are set: 1) to characterize the influence of proinflammatory stimuli on synthesis of hyaluronic acid by astroglial cells; 2) to characterize participation of low-molecular and high-molecular forms of hyaluronic acid in regulation of inflammatory responses of astroglial cells. The project will use both classical methods of cellular and molecular biology, which were effectively used by the project leader for astrocyte research previously, as well as original approaches related to cellular models of acute, subacute and chronic effects of exogenous stimuli of toll-like receptors. Experimental material accumulated during preliminary stages of studies related to characterization of inflammatory responses of astrocytes will be involved. The proposed approaches and methods are relevant, modern and conventional. Within the task # 1, primary cultures of astroglial cells will be obtained according to the methods previously used by the author. Methods of immunocytochemistry will be used to analyze the ratio of cells in a mixed culture using markers: GFAP (astrocytes), CD11b (microglia), DAPI (nuclei). Cells will be treated with agonists of TLR4 (lipopolysaccharide, LPS) and TLR3 (poly IC, PIC) receptors. The levels of expression of hyaluronan synthesis enzymes (HAS1, HAS2, HAS3, UDP-glucuronosyltransferase) will be estimated by real-time PCR and confirmed by western blot. Alterations in the levels of hyaluronan synthesis in astroglial cells subjected to pro-inflammatory stimulation will be determined by ELISA, as well as by immunocytochemical labeling of cell cultures with antibodies against GFAP and labeleding with HABP (hyaluronan binding protein interaction). To determine the mechanisms responsible for regulation of mediators of hyaluronic acid synthesis, the effect of inhibitors of mitogen cascades of activated protein kinases and the transcription factor NF-кВ (SP600125 for JNK, SB 203580 for p38, Bay 11-7082 for NF-KB complex) on the level of expression of enzymes will be analyzed. Effects of 4-methylumbeliferone and aspirin on astroglia mediated hyaluronan synthesis will be evaluated. In task 2, cell cultures will be treated with high molecular weight (MW> 500 kDa) and low molecular weight (MW 10-500 kDa) hyaluronan in a separate treatment regimen or in combination with agonists of TLR3 (Poly IC) or TLR4 (LPS). Immunoblotting or ELISA analysis will be used to analyze alterations in the expression of pro and anti-inflammatory markers of astroglial cells: IL-12, IL-1beta, IL-10, TNFalpha, COX-1, COX-2, iNOS, arginase 1, release profile of PGE2, PGD2, 15d-PGJ2, PGA2, TXB2, and others. As a result of the proposed project, data on interaction between hyaluronan synthesis and inflammatory responses of astroglial cells will be obtained, the hypothesis of involvement of the cyclooxygenase pathway of synthesis of signal lipids into this interaction will be tested, possibility to control these processes by adding low-molecular weight inhibitors, including drugs, will be evaluated.

Решение задач, сформулированных в рамках проекта, углубит понимание участия астроглии в воспалительных процессах в ЦНС, в долгосрочной перспективе может иметь прикладное значение (при разработке терапевтических подходов и лекарственных препаратов). Принципиально важным представляется то, что планируемые в рамках данного проекта исследования позволят ответить на вопрос о том, насколько соотносятся данные, получаемые в рамках модели провоспалительной стимуляции астроглии активаторами ТЛР3 и ТЛР4 рецепторов с ответом, индуцированным эндогенными лигандами – то есть теми веществами, которые обеспечивают активацию астроцитов в условиях настоящих патологий. Участие астроцитов в воспалительных процессах мозга хорошо описано, однако большая часть этих исследований выполнена с использованием провоспалительных стимулов экзогенной природы. Астроциты также известны как основной источник гиалуроновой кислоты в мозге, однако регуляция этого процесса у условиях воспалительного ответа не исследована. Наши результаты позволят выявить условия, при которых возможно переключения синтеза гиалуроновой кислоты астроцитами с провоспалительных низкомолекулярных форм на антивоспалительные высокомолекулярные. Характеристика механизмов действия гиалуроновой кислоты, которую предполагается получить в данном проекте, позволит с новой точки зрения взглянут на систему ТЛР в мозге и предположить возможные механизмы управления участия астроцитов в регуляции нейровоспаления. Кроме того, детальное изучение молекулярных механизмов действия различных форм гиалуроновой кислоты и оценка вовлеченности в механизмы регуляции на клеточном уровне позволит получить результаты актуальные не только для изучения нейровоспаления, но и для понимания общего механизма действия на воспалительные процессы этого гликозаминогликана, важного компонента внеклеточного матрикса. Будет получена зависимость экспрессии основных ферментов метаболизма гиалуронана от действия воспалительных стимулов на астроциты, охарактеризовано влияние низкомолекулярных ингибиторов ключевых компонентов сигнальных путей, взаимосвязь которых предполагается: системы гиалуронана, сигнального пути толл-подобных рецепторов, циклооскигеназного пути синтеза сигнальных липидов. Ожидаемые результаты методически и содержательно соотносятся с материалами, публикуемым журналами с импакт-фактором верхнего квартиля (Топ-25) в области нейробиологии (Journal of Neuroinflammation, IF>5; Journal of Neurochemistry, IF>4), что указывает на соответствие сформулированной проблемы, поставленных задач, используемых методов и подходов мировому уровню. Полученные в ходе проекта результаты имеют значение для развития медицины, так как направлены на понимание механизмов нейровоспаления и поиск низкомолекулярных веществ, с помощью которых можно управлять процессами воспаления в центральной нервной системе.

Автор проекта имеет многолетний успешный опыт работы в области изучения ответа астроглиальных клеток на провоспалительную стимуляцию в условиях клеточных культур, что отражено в публикациях. Руководитель проекта имеет значительный опыт экспериментальной работы с воспалительными процессами в глиальных клетках. Разработаны оригинальные подходы к работе с культурами первичных клеток мозга, а именно, охарактеризованы модели связанные с клеточными моделями острого, подострого и хронического воздействия экзогенных стимулов толл-подобных рецепторов, взаимодействию астроцитов и микроглии, астроцитов и нейронов, накоплен экспериментальный материал предварительных исследований, связанных с характеристикой воспалительных ответов на астроцитах. Методами молекулярной биологии руководителем проекта в ходе работы с астроцитами была изучена регуляция гена циклооксигеназы-2 в модели эндотоксиновой толерантности (Astakhova et.al. 2015, DOI: 10.1134/S0006297915100065), изучена вовлеченность митоген-активируемых протеинкиназ p38, JNK, ERK и MEK1/2 MAPK в регуляцию транскрипционных факторов PPARalpha, PPARbeta и PPARgamma, влияние ингибитора фактора транскрипции NF-кB (Chistyakov et.al. 2015; DOI: 10.1111/jnc.13101). Также руководителем проекта совместно с коллегами впервые показано, что при стимуляции Толл-подобного рецептора 4 на астроцитах происходит стабилизация мРНК ядерных рецепторов PPAR (Chistyakov et.al. 2015; DOI:10.1111/jnc.13101. Изучено изменение скорости деградации для воспалительного маркера гена циклооксигеназы-2 на астроцитах (Pankevich et.al. 2017, DOI: 10.1134/S0006297917110050). Было установлено, что его скорость деградации в клетках линии С6 увеличивается при развитии воспалительного ответа (Pankevich et.al. 2015; DOI: 10.1134/S1990747815050086). Таким образом, методологическая и методическая подготовленность руководителя проекта позволяет ставить перед собой задачи, сочетающие современные экспериментальные подходы методов молекулярной и клеточной биологии.

По задаче 1. Получены зависимости влияния агонистов ТЛР3 (PIC) и ТЛР4 (ЛПС) на экспрессию ферментов синтеза гиалуроновой кислоты HAS1-3 и UDP-глюкуронозилтрансферазы. Измерен соответствующий клеточный ответ (выброс гиалуроновой кислоты). Получены результаты (фотографии) клеточных культур астроцитов, маркированных антителом против GFAP и меченым белком HABP (детекция синтеза гиалуроновой кислоты астроцитами). Результаты данной работы будут подробно изложены в отчете, представлен план статьи по этим результатам. По задаче 2. Получены зависимости экспрессии СОХ-1, СОХ-2, аргиназы 1 на астроцитах, стимулированных агонистами ТЛР3 (PIC) и ТЛР4 (ЛПС) в различных сочетаниях с высокомолекулярными и низкомолекулярными формами гиалуронана. Методами иммуноферментного анализа показаны изменения в экспрессии IL-1b, IL-10, TNFalpha в этих условиях. Получены первичные данные по изменениям ROS и NO в изучаемых условиях. Полученные результаты будут подробно изложены в отчете, представлены в виде графиков, будут приведены фотографии иммунноблотов, фотографии, полученные посредством флуоресцентной микроскопии. Будет представлен план статьи, включающий полученные результаты.