ИСТИНА

Целью предлагаемого фундаментального исследования является выявление механизмов повышения чувствительности опухолевых клеток к индукторам апоптоза, одной из форм программируемой гибели клеток. Стимуляция апоптоза является перспективной стратегией борьбы со злокачественными новообразованиями. Митохондрии играют ключевую роль в инициации/реализации апоптоза, несмотря на то, что энергетика опухолевых клеток в большей степени ориентирована на гликолиз, нежели на окислительное фосфорилирование. Ключевой задачей проекта является исследование взаимопроникновения метаболических путей апоптоза и иных форм клеточной гибели, в частности аутофагии, в гипоксических условиях с целью сделать элиминирование раковых клеток более эффективным. Как апоптоз, так и аутофагия могут быть последствиями стресса эндоплазматического ретикулума (ЭР) и последующей реакции несвернутых белков (unfolded protein response, UPR). Выяснение роли митохондрий в выборе между этими двумя сценариями – является одной из основных задач данного проекта. Особое внимание будет уделено сигнализации между митохондриями и ЭР, осуществляемой активными формами кислорода (АФК), поскольку, с одной стороны, генерация АФК митохондриями может служить фактором, вызывающим стресс ЭР, а с другой стороны, стресс ЭР и последующий выход ионов кальция, способен приводить к пермеабилизации внешней митохондриальной мембраны, точки невозврата в индукции апоптоза. Принимая во внимание гипоксическое окружение опухолевых клеток, будет выявлена роль индуцируемого в условиях гипоксии фактора (Hypoxia Inducible Factor, HIF) в регуляции этих процессов. Полученные в ходе выполнения проекта оригинальные данные данные будут способствовать выработке стратегий, направленных на борьбу со злокачественными заболеваниями.

The purpose of the proposed fundamental study is to identify mechanisms for increasing the sensitivity of tumor cells to inducers of apoptosis, a form of programmed cell death. Stimulation of apoptosis is a promising strategy to combat malignant neoplasms. Mitochondria play a key role in the initiation / realization of apoptosis, despite the fact that the energy of tumor cells is more focused on glycolysis than on oxidative phosphorylation. The key objective of the project is to study the interpenetration of metabolic pathways of apoptosis and other forms of cell death, in particular autophagy, under hypoxic conditions in order to make elimination of cancer cells more efficient. Both apoptosis and autophagy may be consequences of stress of the endoplasmic reticulum (ER) and the subsequent unfolded protein response, (UPR). The elucidation of the role of mitochondria in the choice between these two scenarios is one of the main tasks of this project. In particular, attention will be paid to reactive oxygen species (ROS)-mediated signaling between mitochondria and ER, since, on the one hand, the generation of ROS by mitochondria can serve as a factor that causes ER stress, and on the other hand, ER stress and subsequent release of calcium ions can contribute to permeabilization of the outer mitochondrial membrane, a point of no return in the induction of apoptosis. Taking into account the hypoxic environment of tumor cells, the role of Hypoxia Inducible Factor (HIF) stabilized under hypoxic conditions, in the regulation of these processes will be revealed. The novel data received during the project fulfilment will contribute to the development of strategies aimed at combating malignant diseases.

В результате выполнения проекта станут известны: 1) механизмы стимуляции ЭР стресса и его последствия в нормоксических и гипоксических условиях; 2) особенности регуляции клеточной гибели в гипоксических условиях; 3) роль митохондрий в формировании последствий стресса ЭР при гипоксии; 4) вкладе HIF и сиртуинов в модуляцию ответа клеток на терапевтические агенты в гипоксических условиях. Мы полагаем, что сочетание традиционно применяемых терапевтических средств с модуляторами аутофагии и клеточной энергетики способно повысить эффективность терапевтических стратегий. Попытки решения этой задачи предпринимаются в нескольких ведущих лабораториях мира, поэтому полученные результаты, несомненно, будут восприняты мировым научным сообществом с большим интересом. Выяснение вопроса о том, каким образом гипоксические условия, в которых развивается опухоль влияют на ядерно-митохондриальные взаимоотношения, в процессе клеточной гибели, несомненно послужит фундаментальной основой для создания новых подходов к терапии рака и поиску новых лекарственных средств. Совокупность ранее полученных результатов, а также имеющиеся в лаборатории возможности позволяют надеяться на успешное выполнение поставленных в данном проекте задач. Полученные результаты будут востребованы в научно-исследовательских учреждениях, вовлечённых в разработку и тестирование новых терапевтических соединений.

Ранее нами было показано, что подбором митохондриальных субстратов и использованием специфических ингибиторов дыхательной цепи можно модулировать клеточную гибель, вызванную противоопухолевыми препаратами. Так, удаление глютамина из среды культивирования подавляло апоптоз, вызванный этопозидом, но стимулировало гибель клеток, вызываемую цисплатином. Нами показано вовлечение различных метаболических путей в эти процессы. Было показано, что существенный вклад в устойчивость опухолевых клеток к терапии в условиях гипоксии вносит P-гликопротеин, энергозависимый насос, удаляющий противоопухолевые препараты из клетки. Ингибирование Р-гликопротеина существенно стимулировало апоптоз. Нами обнаружено, что АФК способны регулировать баланс между апоптозом и митотической катастрофой, патологическим состоянием клетки, характеризующимся появлением множественных ядер. Продемонстрирована возможности регуляции клеточной гибели сердечными гликозидами. Обоснована роль митохондрий как мишеней для противоопухолевой терапии. Кроме того, нами были получены предварительные данные о том, что, в зависимости от в различных клеточных линиях в зависимости от активности митохондрий, стимуляция стресса ЭР способна завершиться как апоптозом, так и аутофагией.

В ходе выполнения проекта было показано, что стимуляция гибели клеток, как и подавление энергетики клетки, способно индуцировать стресс эндоплазматического ретикулума (ЭР). В зависимости от типа клеток стимуляция стресса ЭР может завершиться как апоптозом, так и аутофагией. Оба эти процесса взаимосвязаны, так подавление аутофагии в клетках НСТ116 стимулировало апоптоз, индуцируемый цисплатином, тогда как стимуляция аутофагии в клетках SK-N-BE(2) подавляла гибель клеток. Степень стресса ЭР коррелировала с активностью дыхательной цепи митохондрий. Одним из факторов, стимулирующих стресс ЭР являются активные формы кислорода, генерируемые, в том числе, в митохондриях. Поэтому клетки в которых активность митохондрий высока, продукция активных форм кислорода будет выше. Для выяснения вопроса, связано ли это различие в уровне ЭР стресса с активностью митохондрий, оценивали скорость потребления кислорода в обеих клеточных линиях. Действительно, в клетках НСТ116, в которых скорость потребления кислорода была существенно выше нежели в клетках SK-N-BE(2), стресс ЭР был более выражен. Снижение парциального давления кислорода в атмосфере подавляло гибель клеток, при этом стимуляция апоптоза ингибиторами дыхательных комплексов, наблюдаемая в нормоксических условиях, в условиях гипоксии отсутствовала. В условиях гипоксии наблюдалось подавление стресса ЭР, что позволяет рассматривать ЭР как фактор, усиливающий клеточную гибель. Сочетанное действие индукторов стресса ЭР (тапсигаргина и туникамицина) и апоптоза (цисплатин) выявила сложную взаимосвязь аутофагии, апоптоза и стресса ЭР. Наибольшая стимуляция аутофагии наблюдалась при использовании туникамицина, а апоптоза - тапсигаргином. При совместном использовании индукторов стресса ЭР с цисплатином, стимуляция стресса ЭР несколько снижала апоптоз. При этом инкубация с цисплатином снижала содержание маркеров стресса ЭР. Все это показывает, что процессы апоптоза, аутофагии и стресса ЭР способны влиять друг на друга, что может быть использовано для снижения устойчивости клеток к терапевтическим препаратам.