ИСТИНА

Направленная деградация большинства клеточных белков, в том числе и мутантных, осуществляется протеасомой – мультисубъединичным белковым комплексом, присутствующим в клетках всех живых организмов от архебактерий до эукариот. Протеасома представляет большой интерес для изучения, поскольку участвует в патогенезе многих заболеваний, в частности, полиглутаминовых. К последним относят неизлечимые генетические нейродегенеративные расстройства, особенностью которых является накопление мутантных белков с удлиненным полиглутаминовым фрагментом, склонных к образованию плохорастворимых агрегатов. Процесс деградации таких белков детально не изучен, однако известно, что в состав агрегатов также входят протеасомные субчастицы: 20S, 19S и 11S. Протеасома обладает широкой субстратной специфичностью за счет наличия трех типов каталитических субъединиц, обладающих химотрипсиноподобной, трипсиноподобной и каспазоподобной субстратной специфичностью. В некоторых типах клеток иммунной системы, а также под действием провоспалительных цитокинов начинается экспрессия иммунопротеасомы, каталитические субъединицы которой обладают большей способностью гидролизовать пептидные связи после гидрофобных аминокислот, теряя при этом каспазоподобную специфичность. Какая из каталитических субъединиц может гидролизовать протяженные полиглутаминовые тракты, до сих пор остается неясным. Также известно, что существуют компенсаторные механизмы, позволяющие клетке преодолевать низкий уровень внутриклеточного протеолиза путем активации альтернативных путей, в том числе аутофагии, а также экспрессии иммунопротеасомы и/или некоторых внутриклеточных протеаз, но накопление белковых агрегатов в нейронах при полиглутаминовых заболеваниях означает, что либо альтернативные пути не активируются, либо их активация не приводит к ускорению деградации мутантных белков. В связи с этим, проект направлен на изучение взаимосвязи субъединичного состава протеасомных комплексов и их способности гидролизовать белки и пептиды, содержащие полиглутаминовые последовательности, а также ответа протеолитического аппарата разных линий клеток на экспрессию в них хантингтина. Это в перспективе может привести к выявлению новых мишеней для разработки терапевтических препаратов, способных улучшать состояние пациентов, страдающих полиглутаминовыми заболеваниями

Degradation of the majority of cellular proteins, including mutant proteins, is carried out by a proteasome, a multisubunit protein complex functioning in the cells of all living organisms from archaebacteria to eukaryotes. Proteasome is involved in the pathogenesis of many diseases, including polyglutamine diseases. These pathologies are incurable genetic neurodegenerative disorders, a distinctive feature of which is the accumulation of mutant proteins with an elongated polyglutamine fragment, prone to the formation of poorly soluble aggregates. The process of neuronal degradation of such proteins has not been studied in very detail, however, it is known that the aggregates also includes proteasome subparticles 20S, 19S and 11S. The proteasome is a complex enzyme with wide substrate specificity due to the presence of three types of catalytic subunits possessing chymotrypsin-like, trypsin-like and caspase-like substrate specificity. In some types of cells, as well as under pro-inflammatory conditions, the expression of the immunoproteasome occurs, with greater ability to hydrolyze peptide bonds after hydrophobic amino acids, while losing caspase-like specificity. Which of the catalytic subunits (constitutive or immune) can hydrolyze extended polyglutamine tracts is still unclear. Moreover it is also known that compensatory mechanisms exist that allow the cell to overcome a poor level of intracellular proteolysis by activating alternative pathways, including autophagy, as well as expression of the immunoproteasome and/or some intracellular proteases, but the accumulation of protein aggregates in neurons during polyglutamine diseases means that either alternative pathways are not activated, or their activation does not lead to an acceleration of the degradation of mutant proteins. In this regard, the project is aimed at studying the relationship between the subunit composition of proteasome complexes and their ability to hydrolyze proteins and peptides containing polyglutamine sequences, as well as the response of the proteolytic apparatus of different cell lines to the expression of huntingtin. Results of this study can lead in the future to the identification of new targets for the development of therapeutic drugs that can improve the condition of individuals suffering from polyglutamine diseases

Планируется отработать методику, позволяющую биоинформатическими методами выяснить, какая из шести вариантов каталитических бета-субъединиц протеасомы максимально эффективно и продуктивно связывает пептиды, содержащие олигоглутаминовые фрагменты. После выбора оптимальных критериев оценки результатов будет изучено связывание в активных центрах пептидных субстратов, содержащих олигоглутаминовые фрагменты и другие аминокислоты, а также только олигоглутаминовые последовательности.

Научный коллектив состоит из специалистов по молекулярной биологии, биохимии, энзимологии и биоорганической химии, а также студентов. В научном коллективе-заявителе накоплен значительный опыт по экспрессии, выделению и исследованию белков и ферментов, включая протеиназы различных классов, в том числе протеасому. Изучено действие протеасомы и каталитических антител на основной белок миелина, в ходе которого были определены сайты протеолиза ОБМ и кинетические параметры этой реакции. Имеется опыт работы с модельными животными и на клеточных линиях. В научном коллективе-заявителе используются наиболее современные методы исследования, позволяющие получать достоверные сведения о свойствах ферментов и белковых комплексов и их внутриклеточной локализации. Разработанные методы и подходы являются оригинальными, опережают аналогичные зарубежные разработки в данной области и найдут применение в заявленном проекте. В нашем распоряжении имеется необходимое оборудование для выполнения проекта или доступ к нему в рамках Центра коллективного пользования МГУ. Также есть часть реактивов и материалов, необходимых для того, чтобы начать выполнение проекта

Отработана методика для оценки эффективнсти связывания пептидов, содержащих олигоглутаминовые фрагменты, биоинформатическими методами. Изучено связывание в активных центрах пептидных субстратов, содержащих олигоглутаминовые фрагменты и другие аминокислоты, а также только олигоглутаминовые последовательности.