| Результаты этапа: Объектом исследования являлись подземные термальные воды Западно-Сибирского региона, залегающие на глубинах 2–3 км. Предполагается, что они были изолированы от поверхности на протяжении десятков-сотен миллионов лет. Отбор воды в апреле 2016г проводили из нефтепоисковой скважины 5Р, пробуренной в 1950-х годах до глубины 2.8 км в районе пос. Чажемто Томской области. Вода имела температуру 19.8-19.9°С, нейтральный pH (7.43-7.6) и низкий окислительно-восстановительный потенциал (от –304 до -338 mV). Концентрация сульфатов в воде относительно невысока (90,4 мг/л), но в ней имеется растворенный сероводород (15.7±4.3 мг/л). В газовой фазе в основном присутствует метан, который, судя по изотопному составу углерода, имеет преимущественно биогенное происхождение (δ13С/CH4 –59,87-60,03‰).
Для анализа динамики изменений состава микробного сообщества методом пиросеквенирования вариабельного региона V3-V6 гена 16S рРНК мы проанализировали семь проб воды, отобранных в различные моменты времени в течение 26 часов в апреле 2016г (образцы СН1-СН7). Для сбора биомассы микроорганизмов образцы воды (по 3 литра на каждый образец) пропускали через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм. Фильтры гомогенизировали, растирая с жидким азотом, препарат метагеномной ДНК выделяли методом, основанном на лизисе клеток с последующей обработкой детергентом СТАВ (Wilson, 1987). Выделение метагеномной ДНК, амплификацию фрагментов генов 16S рРНК с помощью универсальных праймеров, и их пиросеквенирование проводили по ранее описанной нами методике, (Кадников и др., Микробиология, 2016, том 5, стр 732-739). Для таксономической идентификации микроорганизмов проводили кластерный анализ полученных последовательностей с помощью RDP Tools (https://rdp.cme.msu.edu). Таксономическую принадлежность «репрезентативных» последовательностей кластеров проводили с помощью RDP Classifier (Cole et al., 2009), а также в результате сравнения с последовательностями генов 16S рРНК в GenBank.
Анализ состава микробного сообщества выявил те же основные группы бактерий и архей, которые были обнаружены при анализе образца воды этой скважины, отобранного в сентябре 2015г. (Кадников и др., 2017). Соотношение архей и бактерий в сообществе в образцах 2016г изменялось незначительно (доля архей составляла 36-46% последовательностей 16S рРНК), но в образце 2015г доля архей составляла 56%.
Доминирующими группами бактерий являлись представители филумов Firmicutes, Ignavibacteria, Chloroflexi, Bacteroidetes, Proteobacteria (класс дельта) и Thermotogae, а доли остальных филумов не превышали в среднем 1.5%. Наряду с известными группами были обнаружены также представители кандидатных филумов Acetothermia (OP1), Aminicenantes (OP8), Armatimonadetes (OP10), Atribacteria (OP9), BRC1 и пяти некультивируемых линий, которые не удалось классифицировать даже на уровне филума.
Firmicutes являлись наиболее многочисленной группой бактерий и в среднем составляли около 23% всего микробного сообщества. Большинство Firmicutes было представлено различными «некультивируемыми» линиями, филогенетически удаленными от известных групп. Из культивируемых Firmicutes были обнаружены представители рода Coprothermobacter, - протеолитические бактерии с ферментативным метаболизмом (2.4%), а также Pelotomaculum (3.1%), Syntrophothermus (0.3%) и Syntrophomonas cellicola (0.15%), образующие синтрофные ассоциации с метаногенными археями. Известные представители сульфат-редуцирующих Firmicutes обнаружены не были. Хотя в целом, за исключением одного образца (СН3), доля Firmicutes в сообществе менялась незначительно, на уровне отдельных OTU наблюдались значительные вариации, например, доля Coprothermobacter, изменялась в диапазоне от 0.7% до 3.5%.
Бактерии филума Chloroflexi составляла от 6 до 8% микроорганизмов во всех образцах кроме СН3, в котором к этому филуму относилось 13% последовательностей 16S РНК. Почти все бактерии этого филума относились к семейству Anaerolineaceae, известные представители которого являются гетеротрофами, использующими полисахариды (Yamada et al., 2006), но были филогенетически удалены от культивируемых видов. Интересно, что увеличение доли Chloroflexi в образце СН3 обусловлено большей представленностью лишь одной OTU, доля которой составляла в этом образце 7.8% от всех последовательностей 16S рРНК, а в остальных – не более 0.3%.
Доля бактерий филума Ignavibacteriae изменялась в широких пределах, от 2.4% в образце 2015г (СН0) до 18.6% в образце СН3. Известные культивируемые представители этого филума, Ignavibacterium album и Melioribacter roseus, являются гетеротрофами, использующие различные полисахариды (Liu et al., 2012; Podosokorskaya et al., 2013; Kadnikov et al., 2013). Они могут расти как ферментативно, так и осуществляя процессы аэробного и анаэробного дыхания. Хотя M. roseus был выделен из подземных термальных вод Западно-Сибирского региона (Podosokorskaya et al., 2013), обнаруженные нами Ignavibacteriae были филогенетически удалены как от этого вида, так и от I. album. В меньшем диапазоне изменялась доля Bacteroidetes (от 2.7 до 6.2%), представленных различными линиями, филогенетически удаленными от культивируемых бактерий этого филума.
Дельта-протеобактерии составляли 1.2% сообщества в образце 2015г. и от 2 до 5% в образцах 2016г. Большинство бактерий этой группы относились к порядку Syntrophobacterales, представители которого являются анаэробными хемоорганотрофами, образующими синтрофные ассоциации с метаногенными археями (Garrity et al., 2005). Некоторые бактерии этого порядка, в частности обнаруженного в наших образцах рода Syntrophobacter, также способны восстанавливать сульфат (Chen et al., 2005).
Филум Thermotogae, доля которого в сообществе составляла от 0.8 до 2.5% был представлен родами Fervidobacterium и Mesotoga. Бактерии этих родов являются анаэробными гетеротрофами, характерными для различных термальных экосистем.
В отличие от бактерий, выявленные археи представляли известные родов и видов метаногенов, как гидрогенотрофных, так и ацетокластичеких. Доли представителей других групп архей (Crenarchaeota, Pacearchaeota, Thaumarchaeota, и Woesearchaeota) не превышали 0.1%. Гидрогенотрофные археи порядка Methanobacteriales, доминировали в микробном сообществе и их доля была относительно постоянной (24-30%). Филогенетически они относились к родам Methanobacterium и Methanothermobacter, характерным для подземных термальных вод и нефтяных резервуаров.
В более широком диапазоне менялось содержание архей порядка Methanosarcinales, доля которых составляла от 8.3% до 14.7% в образцах 2016г и 26.4% в образце 2015г. Эта группа была представлена тремя филотипами ацетокластических метаногенов, отнесенными к роду Methanosaeta, - Methanosaeta thermophila, Methanosaeta concilii и новому филотипу этого рода. Относительное содержание этих линий архей менялось в широком диапазоне. Так, доля OTU, отнесенного к Methanosaeta thermophila, составляла 17.7% в образце 2015г и была минимальной в образце СН3 (3.1%), в котором преобладал новый филотип рода Methanosaeta (10.8%), доля которого в остальных образцах не превышала 3.1%.. Methanosaeta concilii была детектирована в образце 2015г (6.1%), но практически отсутствовала во всех остальных образцах кроме СН3, в котором на нее приходилось только 0.8% последовательностей 16S рРНК.
Были обнаружены также представители еще одной группы метаногенов, рода Methanomassiliicoccus (класс Thermoplasmata). Первоначально этот род был обнаружен в в составе микробиома кишечникка (Dridi et al., 2012), но позднее эта линия, Methanoplasmatales, была найдена в разных природных экосистемах (Paul et al., 2012). Доля этой группы изменялась в широком диапазоне в образцах 2016г (от 0.7 до 3.7%), а в образце 2015г ее доля составляла 0.3%.
Полученные нами результаты показали наличие как «постоянной» части сообщества, состав которой меняется незначительно, так и групп микроорганизмов, доли которых в различных образцах на протяжении суток менялась в несколько раз. Сравнение образца, отобранного в сентябре 2015г и семи образцов, отобранных в течение суток в апреле 2016г, показало, что вариабельность состава сообщества в течение одних суток сопоставима с отличиями между образцами разных лет. Особенностью образца 2015г является более высокое содержание ацетокластических архей рода Methanosaeta, и более низкое содержание бактерий Ignavibacteriae и Deltaproteobacteria по сравнению с образцами 2016г. Среди образцов 2016г выделялся СН3, в котором снижение доли Firmicutes сопровождалось увеличением содержания Ignavibacteriae и Chloroflexi.
Микробное сообщество подземного водного резервуара включает как «планктонную» часть, так и микроорганизмы, иммобилизованные на поверхности пород в виде биопленок, причем на их долю может приходиться более 99% всех клеток (McMahon and Pallner, 2014). Иммобилизованные на породах микроорганизмы могут эпизодически вымываться и соответственно детектироваться в вытекающей из скважины воде, что может объяснять наблюдаемые различия в составе микробных сообществ. К планктонным микроорганизмам могут относиться в первую очередь автотрофы, использующие растворенные неорганические соединения. В исследуемом микробном сообществе этот прежде всего гидрогенотрофные метаногенные археи порядка Methanobacteriales, доля которых действительно была относительно постоянной. Вторая, распространенная в подземных экосистемах группа, гидрогенотрофные сульфат-редукторы, отсутствовала. Большинство других микроорганизмов, вероятно, представляют иммобилизованную фракцию или связаны с ней. Об этом свидетельствует большое число обнаруженных групп гетеротрофных бактерий, деградирующих полисахариды, к числу которых относятся Ignavibacteria, Chloroflexi, и возможно Firmicutes. Образуемый этой иммобилизованной фракцией сообщества ацетат и другие низкомолекулярные органические соединения могут использоваться синтрофными ассоциациями, включающими Deltaproteobacteria и Firmicutes в сообществе с ацетокластическими метаногенами рода Methanosaeta. Вариабельность содержания этих групп в сообществе согласуется с их присутствием в биопленках и/или пространственно локализованных участках подземного водного резервуара.
В сотрудничестве с Томским госуниверситетом из воды скважины 5-Р были получены накопительные культуры термофильных бактерий, способных к сульфатредукции. Из накопительных культур, полученных на лактате с сульфатом при температуре 65°С выделено три изолята, которые были представлены изогнутыми палочками и относились к роду Thermodesulfovibrio (Nitrospirae). Штамм V2, выделенный на среде Видделя с нейтральным рН, имел 99% сходство последовательности гена 16S рРНК с Thermodesulfovibrio aggregans. Ацидотолерантный штамм Va, выделенный на среде со слабокислой реакцией (рН 6.0), также имел высокую степень гомологии последовательности гена 16S рРНК с T.aggregans. Третий штамм, RD, представленный малоподвижными клетками, также был близкородственным с T.aggregans (100% идентичность последовательностей 16S рРНК для фрагмента длиной 919 нт). T. aggregans был впервые выделен из высокотемпературного метаногенного ила и описан в 2008 году (Sekiguchi et al., 2008). Не так давно опубликован драфт-геном типового штамма T. aggregans, TGE-P1 (Matsuura et al., 2016). Поскольку выделенные культуры не представляли особого интереса, в качестве объекта метагеномного анализа было выбрано само микробное сообщество подземных вод, а не накопительная культура.
В микробном сообществе термальных вод нефтепоисковой скважины 5Р большую долю составляли некультивируемые линии микроорганизмов, метаболизм и функциональная роль которых неизвестны. Поэтому для характеристики этих некультивируемых линий и сообщества в целом был использован метагеномный анализ. Секвенирование метагенома проводили в ЦКП «Биоинженерия» на платформе Illumina (фрагментная библиотека с размером около 400 нт., секвенирование с двух концов в формате 2х250 нт). В результате было просеквенировано около 16,9 млрд. нуклеотидов, полученные чтения были собраны в 185.598 контигов длиной от 500 нт. Анализ контигов на наличие последовательностей генов 16S рРНК выявил метаногенные археи (Methanosaeta, Methanothermobacter, Methanobacterium и Methanomassillicoccus) и различные группы бактерий, - представителей филумов Firmicutes, Ignavibacteria, Bacteroidetes и нескольких некультивируемых кандидатных филумов. Для «распределения» контигов на кластеры, соответствующие композитным геномам отдельных линий микроорганизмов, использовали программу CONCOCT, которая кластеризует контиги на основе частот встречаемости сочетаний нуклеотидов и покрытия контигов. В результате было собрано 20 геномов, имеющих полноту более 90% (оценка с помощью программы CheckM по наличию набора консервативных однокопийных маркерных генов), в том числе геномы представителей некультивируемых линий. Анализ этих данных на этапе 2018г позволит охарактеризовать генетический потенциал микробного сообщества подземных вод и отдельных его членов, в том числе некультивируемых линий микроорганизмов, провести реконструкция путей метаболизма, охарактеризовать основные биогеохимические процессы и обуславливающие их группы микроорганизмов. |
