ИСТИНА

Взаимодействие между клеткой и субстратом включает в себя передачу механических напряжений через фокальные контакты. Механическое напряжение на фокальных контактах может запускать сигнальные пути, которые ведут к различным эффектам: изменению формы и адгезии клеток, реорганизации цитоскелета, пролиферации или апоптозу, дифференцировке плюрипотентных клеток и т.п. Механозависимые сигнальные пути заставляют клетки реагировать на рельеф и механические свойства субстрата. В рамках проекта планируется исследовать это влияние на примере перевиваемых и первичных эпителиальных клеток на субстратах, полученных методом электроспиннинга из биосовместимых полиэфиров (полилактида, полиоксибутирата). Будет исследовано влияние диаметра и ориентации субстрата на пролиферацию клеток, структуру их цитоскелета и организацию фокальных контактов. Будут сопоставлены реакции клеток, выращенных на субстратах с различным рельефом, на ингибирование ключевых белков-регуляторов актинового цитоскелета (форминов, Arp2/3, Rho).

Цель исследования - определить влияние рельефа и ориентации полимерных субстратов на эпителиальные клетки, а также исследовать некоторые молекулярные механизмы этого влияния. Задачи исследования: 1. Приготовить и охарактеризовать субстраты, имеющие различный диаметр и ориентацию волокон 2. Определить влияние рельефа, ориентации и шероховатости поверхности волокон на адгезию и пролиферацию эпителиальных клеток, а также на организацию актинового цитоскелета и фокальных контактов 3. Сравнить, как проявляются обнаруженные закономерности в первичных и перевиваемых клетках, а также на субстратах из различных полимеров 4. Определить, как реагируют клетки, находящиеся на различных по структуре субстратах, на ингибирование ключевых белков-регуляторов актинового цитоскелета (форминов, Arp2/3, Rho)

Команда проекта имеет большой опыт работы с клетками, полимерными субстратами для их выращивания, исследования регуляции структуры цитоскелета. В 2011-2015 году нами был реализован комплекс методик, которые позволяют сравнивать структуру актинового цитоскелета и механические свойства клеток различных линий, а также клеток, подвергавшихся определенным физико-химическим воздействиям (Yu M Efremov et al., 2011, 2013, 2014; Yu. M. Efremov, Bagrov, Dubrovin, Shaitan, & Yaminskii, 2011; Yu.M. Efremov, Bagrov, Kirpichnikov, & Shaitan, 2015). Этот комплекс методик включает в себя силовую спектроскопию (специальную методику атомно-силового микроскопа), конфокальную микроскопию и проточную цитофлуориметрию. Центральное место в этом комплексе занимает методика измерения модуля Юнга клеток с помощью кантилеверов, модифицированных микросферами. Традиционная силовая спектроскопия с использованием стандартных кантилеверов требует снятия большого количества силовых кривых с каждой клетки (не менее 20) и дает существенно разные значения модуля Юнга (в пределах клетки они могут варьироваться на порядок) в зависимости от того, попало ли острие кантилевера на волокно кортикального актинового цитоскелета. Кроме того, получаемые результаты существенно меняются при налипании белков или других молекул из раствора на кончик кантилевера. Нам удалось устранить эти недостатки с помощью кантилеверов, у которых на конце вместо острия расположена микросфера с диаметром 8-10 мкм.