Трансформация хряща перегородки носа в тканеинженерную конструкцию для ортопедии с использованием ИК лазерного излученияНИР

Transformation of the nasal septum cartilage into the tissue engineering construction for orthopedics using infrared laser radiation

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Трансформация хряща перегородки носа в тканеинженерную конструкцию для ортопедии с использованием ИК лазерного излучения
Результаты этапа: Показано, что при воздействии на соединительную ткань ИК лазерным излучением при температурах свыше 50С, но ниже температуры денатурации коллагена (около 65С) происходит гибель клеток и разрыхление коллагенового каркаса ткани. Создана экспериментальная установка для определения температуры на передней и задней поверхности ткани при ИК лазерном воздействии. Методом дифференцимальной сканирующей калориметрии определены доли денатурированного коллагена в гиалиновой части и надхрящнице, методом сканирующей электронной микроскопии определены изменения морфорлогии матрикса, методом гистиохимического анализа определены возможности гибели клеток. Определены оптимальные режимы бесконтактного ИК лазерного воздействия (диаметр лазерного пятна 5 мм) на образцы хрящевой ткани (система хрящ-надхрящница) толщиной 2.5 мм с двух сторон. При таких воздействиях температуры в течении 15-25 с составляют: со стороны гиалиновой части около 65, на глубине 1-2 мм около 62С, на глубине 2.5 мм не более 60С. Показано, что лазерное излучение с длиной волны 1.56 мкм (характерная глубина проникновения излучения 0.8 мм) не обеспечивает нужных условий объемного прогрева, но с длиной волны 1.68 мкм (характерная глубина проникновения излучения 2 мм) происходит объемный прогрев. Оптимальными являются следующие параметры: мощность 4—5.5 Вт, скважность 200 мс/(200-500 мс). В непрерывном режиме время воздействия недостаточно для гибели клеток, при больших/меньших длительностях импульса происходит денатурация коллагена надхрящницы либо за счет фототермическогог эффекта (длинные импульсы), либо за счет фотомеханического эффекта (короткие импульсы). Последующая лазерная обработка со стороны надхрящницы в режиме 4 Вт, скважность 400 мс/300 мс, длительность воздействия 20 с, максимальная температура поверхности 58С , не приводит к денатурации коллагена надхрящницы. Показано, без предварительной процедуры заморозка оттаивание происходит гибель клеток с деформацией ее ядер. После предварительной заморозки или выдерживания в гипотоническом растворе солей магния и натрия (ионная сила I=0.11) ИК лазерное воздействие приводит к разрушению клеточных мембран, частичной деструкции ядер, заполнению лакун клеток и разрыхлению каркаса матрикска с сохранением коллагеновых фибрилл и содержания гликозаминогликанов. Последовательные заморозка-разморозка-выдерживание в растворе солей-двусторонняя лазерная обработка приводят к полному разоушению клеточных мембран, деструкции ядер до практически полного растворения и значительному разрыхлению волокнистого каркаса матрикса с сохранением коллагеновых фибрилл и содержания гликозаминогликанов. Таким образом такая обработка является оптимальной для первого этапа заготовки ткане-инженерной конструкции.
2 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Трансформация хряща перегородки носа в тканеинженерную конструкцию для ортопедии с использованием ИК лазерного излучения
Результаты этапа: Заготовки для тканеинженерной конструкции, полученные на этапе 1 были проанализированы методом нелинейной оптической микроскопии в режиме генерации второй гармоники (ГВГ). Анализ ГВГ микрофотографий показал, что коллагеновая сеть в целом сохраняется, однако оказывается в некоторой степени дезорганизована. Показано, что 24 ч обработка трипсином (1 мг/мл) при комнатной температуре приводит к удалению 55-63% гликозаминогликанов. ДСК анализа показал сохранение нативных макромолекул коллагена, однако снижение температуры денатурации до 61С указал на дальнейшую дезорганизацию волокнистого каркаса матрикса. Был определен режим двустороннего контактного ИК лазерного облучения через оптическое волокно лазера (длина волны 1,56 мкм) диаметром 400мкм приводящей к локальной денатурации коллагена в точках воздействия (2,5 Вт, 50 мс). Повторная трипсинизация в течении 24 ч при комнатной температуре приводила к вымыванию олигопептидов коллагена в раствор трипсина. Морфологический анализ показал, что после такой обработки и тщательной промывке заготовок на воронке Шотта в заготовке образовались двусторонние несквозные полости диаметров 100-200 мкм, а большая часть клеточных лакун – пустые, коллагеновые волокна повреждены. ДСК анализ подтвердил наличие интактных макромолекул коллагена, однако температура денатурации коллагена уменьшилась до 55С. Механические испытания показали трехкратное уменьшение модуля Юнга по сравнению с исходными образцами. Для восстановления механических свойств системы проводили сшивание коллагенового волокна. В качестве сшивающих агентов впервые использовали прекурсор ацетальдегида (ПА) - диэтилацеталь и рибозу при pH 3-5. Показано, что выдерживание в растворах этих веществ приводит к увеличению стабильности коллагенового каркаса. Так, выдерживание в растворе ПА от 1 до 2 суток температура денатурации возрастает от 61 до 63С, а модуль Юнга увеличивается на 420-480% по сравнению с дважды трипсинизированной тканью. Обработка рибозой в течении 5 дней приводит к возрастанию температуры денатурации до 61С и увеличению модуля Юнга на 300-320%. В конечном итоге получена бесклеточная коллагеновая пористая конструкция с нужными механическими свойствами для замещения дефекта суставного хряща.
3 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Трансформация хряща перегородки носа в тканеинженерную конструкцию для ортопедии с использованием ИК лазерного излучения
Результаты этапа: Полученные на этапах 1 и 2 тканеинженерные конструкции были исследованы методом классической и нелинейной оптической микроскопией, была определена их протеолитическая устойчивость и проверена цитотоксичность. Общая структура матрикса хрящевой ткани в полученных образцах сохранялась тонковолокнистой и анизотропен. Сохранялись разные структуры конструкции, соответствующие гиалиновому хрящу и надхрящницы. Архитектоника коллагенового каркаса гиалиновой части существенно изменилась: структура стала более плотной, и волокна собрались в пучки. В надхрящнице волокна сохранили ориентацию, параллельную поверхности образца. Около 70 % лакун хондроцитов оказались пустыми, оставшиеся содержали ядра в состоянии кариопикноза или кариорексиса. При окраске по Фельгену красная окраска ДНК не выявлялась ни в одном образце. Таким образом конструкции оказались свободны от ДНК. Деградацию образцов проводили с помощью препарата «Морикраза. В отличие от несшитых обпразцов , сшитые образцы не растворялись под действием ферментов и устойчивость возрастала до 155%, 406%, 603%, 753% для образцов сшитых рибозой в течении 48 и 120 часов и глицериновым альдегидом в течении 24 и 48 часов соответственно. Цитотоксичность образцов определяли в соответствии со стандартами серии ГОСТ Р ИСО 10993 "Оценка биологического действия медицинских изделий". В качестве контроля выступали несшитые образцы. Морфология, активность и жизнеспособность клеток не менялась по сравнению с контролем, лишь для образцов, сшитых глицериновым албдегидом наблюдалась тенденция к ингибированию роста клеток и рост клеток составлял 85±5 % от контроля. Результат очевиден, имея ввиду, что рибоза является естественным веществом для организмов, в то время как глицериновый альдегид - нет. Таким образом, после сшивания образцов глицериновым альдегидом требуется более тщательная отмывка образцов. В результате выполнения проекта отработана методика создания двуслойной бесклеточной конструкции c контролируемой стабильностью.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".