Изучение паттерна сплайсинга мРНК в тимусе и его взаимосвязь со спектром Т-клеточных аутоантигеновНИР

Study of mRNA splicing pattern in the thymus and its interconnection with T cellular autoantigenes

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Изучение профиля экспрессии мРНК в тимусе
Результаты этапа: Для оценки предположения о том, что часть Т-клеточных аутоантигенов, вызывающх аутоиммунные заболевания, связана с невозможностью тимуса представить в ходе отрицательной селекции все возможные сплайс-формы мРНК, мы изучили транскрипционный профиль клеток тимуса мыши, в том числе эпителиальных клеток. На основе опубликованных работ зарубежных коллег мы отобрали 10 генов, сочетающих экспрессию в тимусе и большое число сплайсформ (Add2, Dclk1, Dst, G6pc2, Golga7, Lmna, Magi2, Mbp, Nasp, Ubtf) и провели определение набора их сплайсформ в органах и тканях мыши, ее тимоцитах и отсортированных клетках эпителия тимуса методом аллелеспецифической ПЦР в реальном времени. Работа позволит лучше понять механизмы ухода аутореактивных Т-лимфоцитов от отрицательной селекции и имеет фундаментальное значение для иммунологии аутоиммунных заболеваний. В тимусе в целом и в эпителиальных клетках была показана экспрессия всех десяти генов-мишеней, однако для двух генов (Add2 и Dst) она присутствовала на уровне около 0,01% от экспрессии контрольных генов домашнего хозяйства (цитохром с и бета-актин), что осложняет анализ экзонного состава сплайсформ мРНК. Восемь генов с более высоким уровнем экспрессии удалось разделить на две группы - для пяти генов обнаружился дисбаланс в соотношении сплайсформ мРНК с преобладанием определенных слайсформ (G6pc2, Golga7, Lmna, Magi2, Nasp), а для трех генов – сбалансированный транскриптом, сочетающий проанализированные сплайсформы в сопоставимых соотношениях (Dclk1, Mbp, Ubtf). Мы предполагаем, что для генов с дисбалансом сплайсформ в тимусе существуют аутоантигены, связанные с минорными изоформами, в частности для ламина А (Lmna) в тимусе слабо представлена изоформа А, для антигена 7 комплекса Гольджи (Golga7) слабо представлена изоформа 2, для ядерного антигена сперматозоидов (Nasp) также слабо представлена изоформа 2 (наиболее длинная). В тоже время для глюкозо-6-фосфатазы (G6pc2) и киназы Magi2 наиболее представлены полноразмерные формы, содержащие в себе все потенциальные Т-клеточные антигены, что облегчает процесс отрицательной селекции в тимусе. Эпителиальные клетки тимуса имеют дифференциальный паттерн сплайсинга мРНК для некоторых генов, что с одной стороны позволяет предоставлять для отрицательной селекции Т-лимфоцитов максимальное число потенциальных аутоантигенов, таких как глюкозо-6-фосфатаза, но с другой стороны по этой же причине не позволяет презентировать некоторые аутоаэпитопы, такие как С-концевые эпитопы ламина А. Работа выполнена на современном методическом уровне, имеет фундаментальное значение для изучения процессов селекции Т-клеток в тимусе и представляет собой функциональный задел для дальнейшего изучения аутореактивных Т-лимфоцитов в моделях с использованием лабораторных животных.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Анализ Т-клеточных эпитопов экспрессирующихся в тимусе аутоантигенов
Результаты этапа: В ходе второго этапа работы был проведен более детальный анализ спектра экспрессии сплайсформ 10 кандидатных генов в тимусе и панели органов (расширенной путем добавления мРНК из яичников и семенников), который подтвердил перспективность выбора генов Golga7, Lmna и Nasp. Для трёх этих генов в плазмиду pET-28b были клонированы изоформы А и С для ламина A/C, изоформы 1 и 2 для гольджина 7, изоформы 1 и 2 для белка Nasp. Основой для клонирования послужили мРНК, выделенные из семенников (в случае Nasp) и головного мозга (в случае гольджина 7 и ламина А/С). Для более длинных и хуже представленных в тимусе изоформ белков (ламин А, изоформ 2 гольджина и Nasp) с помощью базы данных IEDB были предсказаны потенциальные Т-клеточные эпитопы для мышей C57BL/6 (аллель b локуса MHC H-2). При участии коллабораторов из ИБХ РАН были синтезированы искусственные пептиды, соответствующие наиболее иммуногенным эпитопам.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Анализ Т-клеточных эпитопов экспрессирующихся в тимусе аутоантигенов
Результаты этапа: Из трех генов, подходящих для проверки иммуногенности сплайсоформ их белков (Golga7, Lmna, Nasp), последовательности которых были клонированы, для экспериментальной проверки возможных различий иммуногенности был выбран Golga7 по причине своего небольшого размера и удобства экспрессии. Гольджин 7 представляет собой небольшой белок (размер сплайсоформы 1 - 137 аминокислот, размер сплайсоформы 2 - 153 аминокислоты), являющийся компонентом пальмитоилтрансферазного комплекса аппарата Гольджи. Первые 89 аминокислот обоих изоформ одинаковы, среди них содержатся пальмитоилированные остатки цистеина, в норме удерживающие этот белок на мембране. Обе сплайсоформы были клонированы в плазмиду pET-28b и наработаны в клетках E. coli штамма Rosetta, с учетом технических последовательностей (линкер и гексагистидиновые тэги на N- и C-концах), размер составлял 179 и 195 аминокислот соответственно. Последовательности генов были подтверждены с помощью секвенирования плазмид, идентичность выделенных белков была подтверждена масс-спектрометрией. Рекомбинантными белками, а также контрольным антигеном – лизоцимом куриного яйца (129 аминокислот) были иммунизированы мыши линии С57BL/6, возрастом от 2 до 6 месяцев, от 6 до 10 мышей в группе, контрольная группа осталась неиммунизированной. Иммунизация проводилась внутрибрюшинно, доза составляля 20 мкг белка с полным адъювантом Фрейнда, через 2 недели проводили повторную иммунизацию тем же количеством с неполным адъювантом, спустя 4 недели эксперимент прекращали, мышей эвтаназировали и исследовали плазму крови и селезенку. Сравнение титров антител к использованным белкам методом ИФА выявило, что обе рекомбинантные сплайсоформы гольджина несколько более иммуногенны, чем лизоцим, при этом между сплайсоформами имеется высокая кросс-специфичность, обусловленная высокой долей идентичных последовательностей. При этом мыши во всех группах чувствовали себя нормально, небольшая потеря веса в начале эксперимента в иммунизированных группах была вызвана использованием адъюванта. Анализ выделенных по окончании эксперимента спленоцитов не выявил различий между основными популяциями лимфоцитов, включая CD3+ CD4+ CD25+ популяцию (регуляторные Т-клетки + активированные Т-хелперы). Анализ экспрессии Aicda (индуцируемая активацией лимфоцитом цитидин-дезаминаза Aid) выявил повышение этого параметра у обеих групп иммунизированных гольджином мышей, но, как и в случае титра антител, без различий между сплайсоформами. Для поиска антиген-специфических Т-клеток спленоциты были рестимулированы антигенами in vitro. Рестимуляцию проводили в 24-луночных планшетах, в двух вариантах: 1) с использованием только спленоцитов из иммунизированных мышей, 500 тыс. клеток на лунку + 1 мкг белка, инкубация в течение суток; 2) с использованием предварительно полученных костномозговых макрофагов, 500 тыс. макрофагов + 1 мкг белка + 500 тыс. спленоцитов, инкубация в течение суток; после рестимуляции измеряли экспрессию Aicda и долю CD3+ CD4+ CD25+ клеток. Рестимуляция показала, что спленоциты от неиммунизированных мышей, как и до рестимуляции, имеют меньшую экспрессию гена дезаминазы Aid, достоверных различий других параметров не наблюдалось. На основании совокупности параметров (масса и клеточность селезенок, динамика титра антител между 2 и 4 неделями, экспрессия Aicda) можно сделать вывод о несколько большей иммуногенности гольджина 7 по сравнению с куриным лизоцимом (хотя p= 0,05 и менее достигается только по отношению к различиям между иммунизированными группами и контрольной группой). Различий в иммуногенности между сплайсоформами 1 и 2 гольджина 7 не было обнаружено, более того, ИФА показал высокую кросспецифичность антител между сплайсоформами, что согласуется с тем, что основной биоинформатически предсказанный В-клеточный линейный эпитоп находится в общей N-концевой части этих белков. Таким образом, можно заключить, что дисбаланс паттерна сплайсинга в тимусе приводит к различиям в соотношении сплайсоформ белков между тимусом и другими органами, однако обычно это не влияет на иммуногенность таких сплайсоформ, что, по-видимому, объясняет небольшое число клинически актуальных аутоиммунно-вовлеченных белков с множественными сплайсоформами.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".