Фитогормональная активность дрожжейНИР

Phytohormonal activity of the yeast

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Фитогормональная активность дрожжей
Результаты этапа: Объектами исследования были 147 штаммов дрожжевых грибов, относящиеся к 37 видам, выделенные из филлосферы и из цветков, с корней и из ризосферы цветковых растений, из почвы, со мхов и водорослей, из морского и пресноводного ила и с прочих субстратов. Из них 124 штамма были исследованы на присутствие ауксина в культуральной жидкости, 100 штаммов были исследованы на присутствие зеатина. Места выделений штаммов находились как в умеренных широтах, так и арктических и субарктических регионах и тропиках. Штаммы были идентифицированы на основании данных нуклеотидных последовательностей D1/D2 доменов рДНК и хранились в 15% растворе глицерина при -20ºС в коллекции кафедры Биологии почв факультета почвоведения. Для культивирования дрожжей использовали инокулят в количестве 2-х захватов петли, который вносили в микробиологические матрацы на 250 мл (Greiner) с 50 мл среды, и инкубировали на шейкере в течение 10 сут в термостате при 20ºС. Среду для культивирования дрожжей готовили из расчёта 6.7 г азотной основы (Fluka) и 5 г глюкозы на один литр воды (Kurtzman, Fell, 1998). После окончания культивирования культуральную жидкость, необходимую для анализа, отделяли от биомассы дрожжей центрифугированием в течение 10 мин при 11500g на центрифуге R 5810 (Eppendorf). Биомассу использовали для расчета удельной концентрации фитогормонов. Для экстракции ИУК культуральную жидкость подкисляли до pH 3 муравьиной кислотой и наносили на концентрирующий патрон С-18 500 мг фирмы «Cromabond» (США), пропуская со скоростью 1 капля/сек (Ma et al., 2008). Патрон предварительно подготавливали пропусканием последовательно 5 мл воды и 5 мл этанола. Прошедшую через патрон культуральную жидкость отбрасывали, а ауксин смывали 5 мл смеси этанол–вода–муравьиная кислота (80:20:0.5% об/об) в отгонную колбу. Для экстракции зеатина подкисленную культуральную жидкость пропускали через катионит Dowex, предварительно подготовленный пропусканием 1М муравьиной кислоты. Прошедшую через патрон культуральную жидкость отбрасывали, а зеатин смывали 0,35М гидроксидом аммония. Далее элюат нейтрализовывали муравьиной кислотой и наносили на концентрирующий патрон С-18 500 мг фирмы «Cromabond» (США) и затем зеатин смывали 5 мл метанола. Экстракты концентрировали в роторном испарителе (50 об/мин) при 30ºС (Lu et al., 2010) до конечного объёма ≤0.5мл. Полученный концентрат переносили в хроматографическую виалу объемом 1.5 мл, а в колбу для упаривания добавляли 0.5 мл ацетонитрила и помещали в ультразвуковую ванну на 1 мин для отделения определяемых соединений от стенок колбы. Ацетонитрил из колбы также переносили в виалу, после чего ещё раз добавляли в колбу 0.5 мл ацетонитрила и повторяли обработку. При необходимости доводили содержимое виалы ацетонитрилом до 1.5 мл. Количественное определение ИУК проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent 1200 series c квадруполь-времяпролетным масс-спектрометрическим детектором (6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS Agilent Technologies). Источник ионизации – электроспрей(-), Колонка ВЭЖХ RP-8 3.5 мкм 4.6×200 мм. Скорость потока элюента 0.5 мл/мин. Подвижная фаза – муравьиная кислота 10 мМ и ацетонитрил (60:40 об/об) Объем вводимой пробы – 25 мкл. Температура термостата колонок – 30ºС. Показано, что 92% исследованных дрожжей способны к синтезу ауксина и 65% - к синтезу зеатина. Средняя продукция ауксина дрожжами исследованной выборки составила 605,6 мкг/г. Наибольшие значения концентрации ИУК в культуральной жидкости были обнаружены у штаммов Metschnikowia pulcherrima (КБП Y-5623) – 7990.4 мкг/г, Saccharomyces serevisiae (КБП Y-4511) – 5060,6 мкг/г сырой биомассы. Средняя продукция зеатина у исследованных штаммов – 77,87 нг/г сырой биомассы. Наибольшие значения зафиксированы у штаммов Sporobolomyces roseus (КБП Y-5432 и КБП Y-5472) - 789,70 и 881,21 нг/г соответственно. Полученные результаты показали, что способность к синтезу ауксина и зеатина у штаммов одного вида значительно различается, демонстрируя ярко выраженную штаммовую зависимость этого признака. Например, для вида Rhodotorula mucilaginosa, представленного в настоящем исследовании 29 штаммом, разброс концентраций ауксина в культуральной жидкости составил от 12,2 до 1139,1 мкг/г, а зеатина от 9,4 до 354,7 нг/г. Результаты проведенного нами анализа показывают, что активность биосинтеза ауксина у аскомицетовых дрожжей в среднем на 60% выше чем у базидиомицетовых. Именно среди аскомицетов нами были обнаружены наиболее активные штаммы-продуценты ИУК – Metschnikowia pulcherrima (штамм КБП Y-5623), Saccharomyces serevisiae (КБП Y-4511), выделенные с растительных субстратов: с гроздей винограда и с корней осоки топяной. Однако предыдущие исследователи среди наиболее активных продуцентов указывали различные виды рода Rhodosporidium, который относится к базидиомицетам. Тем не менее, наши результаты с привлечением представительной коллекции как аскомицетовых, так и базидиомицетовых дрожжей показывают, что некоторые штаммы аскомицетов могут производить ауксина практически столько же, сколько наиболее активные представители рода Rhodosporidium, разница составляет всего 18%. Исследованные представители подотделов аскомицетов (Saccharomycotina и Pezizomycotina) не отличаются по средней ауксиногенной активности. Среди базидиомицетов наиболее активно образовывали ИУК дрожжи из подотдела Ustilaginomycotina, представленные в исследовании родом Pseudozyma, их фитогормональная активность составляла 599-1317 мкг/г (рис. 1). Стоит отметить, что многие дрожжевые представители Ustilaginomycotina, тесно ассоциированы с растениями, являясь анаморфными филогенетическими линиями среди телеоморфных фитопатогенов. По активности синтеза зеатина выделяется подотдел аскомицетовых дрожжей Taphrinomycotina(от 61 до 541,2 нг/г) , представители которого также являются анаморфными филогенетическими линиями среди телеоморфных фитопатогенов ассоциированных с растениями. Способность к синтезу ИУК исследованных штаммов дрожжевых грибов также проявляла некоторую региональную зависимость. Разделение выборки на три крупные группы синтетиков ауксинов: тропическую, умеренного пояса (в основном, средняя полоса России) и группу из экстремальных местообитаний (Арктика, субарктический регион и высокогорья), показало заметные различия . Можно предположить, что полученные высокие значения продукции ИУК, показанные для штаммов из тропиков, могут отражать высокий уровень межвидовой конкуренции среди растений данного региона. Сравнение штаммов, выделенных из почвы и с растений, показано, что их средняя ИУК-продуктивность заметно различается, составляя, в среднем, 344 и 716 мкг/г, соответственно. Показано, что 28 из 29 исследованных штаммов Rhodotorula mucilaginosa обладают способностью к синтезу одновременно и ауксина и зеатина. Данный вид является доминантом среди дрожжей в средней полосе. Полученные результаты показывают, что фитогормональная активность дрожжевых грибов, связанная с синтезом 3-индолилуксусной кислоты и зеатина является очень распространенным явлением. Поскольку надземные вегетативные и генеративные органы растений, а также ризосфера являются типичным местообитанием многих видов дрожжевых грибов, можно предположить, что дрожжевое население растений обладает особой регуляторной ролью, оказывающей влияние на рост и развитие растений.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Фитогормональная активность дрожжей
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".