ИСТИНА

Немышечный актин у человека представлен двумя изоформами – бета- и гамма-цитоплазматическими актинами. Цитоплазматические актины организованы в многообразные цитоскелетные структуры и выполняют различные роли в клетках (Dugina et al., 2009; 2015). Бета-актин отвечает за сокращение и адгезию, в то время как гамма-актин преимущественно организует кортикальную сеть, необходимую для поддержания формы и подвижности клеток. Перестройка актинового цитоскелета в течение митоза необходима для регуляции клеточного деления. При клеточной трансформации и прогрессии опухоли соотношение и организация цитоплазматических бета-актина и гамма-актина меняется (Shagieva et al., 2012; 2017). Показано сильное увеличение доли многоядерных клеток в культуре эпителиальных клеток при подавлении экспрессии бета-актина, но не гамма-актина (Dugina et al., 2009). Более того, цитоплазматический бета-актин воздействует как опухолевый супрессор, подавляя размножение и инвазию опухолевых клеток in vitro и рост опухолей in vivo. В противоположность этому, гамма-актин стимулирует опухолевый потенциал клеток посредством киназ ERK1/2, актин-связывающих белков и других регуляторных белков (Dugina et al., 2015). Сигнальные пути митоген-активированных киназ ERK1/2 контролируют процессы клеточной пролиферации, дифференцировки, подвижности и апоптоза. Мы полагаем, что существует механизм положительной обратной связи между активацией MAP-киназ и содержанием или активностью гамма-актина, который ведет к усилению злокачественности опухолевых клеток. Вещества, подавляющие экспрессию гамма-актина и/или стимулирующие экспрессию бета-актина можно рассматривать в качестве кандидатов для использования в противоопухолевой терапии. Потенциальными регуляторами актинов могут оказаться актин-связывающие белки, которые, с большой вероятностью, селективно контактируют с бета- или гамма-актином. Регуляция пролиферации опухолевых и нормальных клеток является актуальной научной проблемой, влияющей на развитие и усовершенствование клинической онкологии. Ранее актин рассматривался как мишень для химиотерапии с точки зрения его участия в подвижности опухолевых клеток, но неспецифичность в отношении изоформ и связанная с этим токсичность не давала развиваться этому направлению. Полученные в проекте данные потенциально откроют новые возможности для регуляции не только передвижения, но и пролиферации опухолевых клеток. В опухолевых клетках часто наблюдают изменения сигнального каскада ERK1/2, поэтому механизмы влияния на активность участников каскада уже давно находится в поле зрения фундаментальной и клинической онкологии. В случае подтверждения существования тесного взаимодействия киназы ERK1/2 и гамма-актина, появится новая мишень для таргетного воздействия, а также возможность комплексного действия с аддитивным или синергичным эффектом при лечении онкозаболеваний. Научная новизна проекта заключается в обнаружении не исследованных ранее связей цитоплазматических актинов с участниками сигнального пути митоген-активированных киназ и белками-регуляторами клеточного цикла. Данный проект подчеркивает новаторскую идею регуляторной значимости динамичных актиновых систем.

In human cells non-muscle actin exists in two protein isoforms - beta-and gamma-actin. Cytoplasmic actins are organized in different cytoskeletal structures and are responsible for distinct functions (Dugina et al., 2009; 2015). Beta-actin participates in contraction and adhesion, whereas gamma-actin is predominantly organized in cortical and lamellar networks essential for cell shape maintenance and cell motility. Reorganization of the actin cytoskeleton during mitosis is crucial for regulation of cell division. The relative abundance and organization of cytoplasmic beta- and gamma-actins change in the course of cell transformation and tumor progression (Shagieva et al., 2012; 2017). Previously, we have discovered that downregulation of beta-actin, but not gamma-actin, increases the number of multinucleated cells in epithelial cell culture (Dugina et al., 2009). Moreover, cytoplasmic beta-actin acts as a tumor suppressor, inhibiting cell growth and invasion in vitro and tumor growth in vivo. In contrast, gamma-actin increases the oncogenic potential via ERK1/2, actin-binding proteins (ABPs) and other regulatory proteins (Dugina et al., 2015). Mitogen-activated protein kinases ERK1/2 control cell proliferation, differentiation, motility and apoptosis. We propose that there is a positive feedback loop between ERK1/2 activation and γ-actin expression/functionality that enhances malignant traits of neoplastic cells. Agents that decrease gamma-actin expression and/or increase beta-actin expression may be useful for anticancer therapy. For example, actin-binding proteins are potential isoform-specific actin regulators that selectively bind to beta- and gamma-actin. Regulation of tumor and normal cell proliferation is a topical scientific problem with potential outcome in the development and improvement of clinical oncology. Until recently actin was considered as a desirable chemotherapeutic target due to its participation in motility and metastasis of tumor cells, but non-specificity to isoforms and associated with it toxicity prevented developing of this trend. The project results have the potential to open new opportunities for regulation not only motility, but also the proliferation of tumor cells. The variations of ERK1/2 signaling pathway are often observed in the tumor cells, and targeting the components of this cascade represents an important strategy in fundamental and clinical oncology. The confirmation of close interaction between ERK1 /2 kinase and gamma-actin would provide a new target for anticancer therapy that has the potential to produce an additive or synergistic effect in the cancer treatment. The project results would reveal for the first time the new aspects of interplay between cytoplasmic actins, MAP-kinases and other cell cycle regulators. This project underlines the innovative idea of the regulatory importance of dynamic actin systems.

1. Планируется показать, что расположение разных актиновых систем в течение клеточного цикла неодинаково - гамма-актин преимущественно образует подмембранную кортикальную сеть, в то время как бета-актиновые пучки постоянно реорганизуются в зависимости от потребности клеток в сократимых структурах. 2. Ожидается, что снижение экспрессии и/или изменение в структуре актиновых филаментов приведет к разнообразным митотическим дефектам, выраженность и форма которых будет зависеть от изоформы актина, на которую будет направленно наше воздействие. 3. Планируется получить данные по длительности фаз клеточного цикла и митоза при модификации актинового цитоскелета. 4. Планируется продемонстрировать влияние разных популяций актина на белки-регуляторы клеточного цикла, такие как циклины и циклин-зависимые киназы, а также на белки, меняющие их активность; 5. Планируется получить данные о белковых комплексах, в состав которых входят цитоплазматические актины и сигнальные молекулы, в том числе регуляторы клеточного цикла.

Полученные в проекте данные откроют новые возможности для регуляции не только передвижения, но и пролиферации опухолевых клеток. Научная значимость проекта заключается в обнаружении не исследованного ранее специфического воздействия цитоплазматических актинов на сигнальные каскады, участвующие в прохождении клеточного цикла. Полученные в проекте данные потенциально интересны в сфере современной медицины для более точной диагностики и эффективного лечения опухолевых заболеваний с индивидуальным подходом к воздействию на определенные типы опухолей, а также могут послужить материалом для учебных пособий для биолого-медицинских вузов.

В рамках Проекта были получены предварительные данные об организации популяций актиновых филаментов в процессе деления в нормальных и опухолевых клетках. В нормальных эпителиальных митотических клетках была обнаружена четкая сегрегация и различное распределение изоформ немышечного актина на стадиях анафазы, телофазы и цитокинеза. Использование уникальных специфических моноклональных антител к цитоплазматическим изоформам актина, иммунофлуоресценции и конфокальной лазерной микроскопии позволили выявить, что бета-актин находится в экваториальной области во время анафазы, в сократительном кольце во время телофазы и цитокинеза. Гамма-актин в течение всего митоза и цитокинеза преимущественно находится в виде густой сети в субкортикальном слое клеток. Аналогичное распределение немышечных актинов в течение деления было обнаружено и в клетках рака молочной железы линий MCF-7 и MDA-MB-231. Локализация бета-актина в сократительном кольце во время телофазы и цитокинеза служит аргументом в пользу его роли в процессе сокращения. В дальнейшей работе мы планируем расширить данные о пространственной организации изоформ актина в течение деления и подготовить к печати публикацию. Специфическая роль именно бета-актина в процессе разделения дочерних клеток подтвердилась в дальнейших экспериментах с использованием метода малых интерферирующих РНК (миРНК) в клетках рака молочной железы. Снижение экспрессии любой из изоформ подавляло пролиферацию клеток рака молочной железы. Впервые было показано, что именно супрессия бета-актина дополнительно к подавлению пролиферации вызывала значительное снижение популяции диплоидных клеток и накопление тетраплоидных и анеуплоидных клеток. Методом проточной цитометрии была проведена оценка влияния экспрессии цитоплазматических актинов на распределение популяций опухолевых клеток по стадиям клеточного цикла. Обработка результатов при помощи программы ModFit помогла выявить, что в контрольной культуре MCF-7 практически все клетки были диплоидными (96,5 ± 3,5%). На 4-6 сутки подавления бета-актина в клетках MCF-7 количество диплоидных клеток снизилось и составило 82,3 ± 2,4%. Это сопровождалось увеличением популяции клеток на стадии G2/M и уменьшением популяции G0/G1. Аналогичные изменения были выявлены и в клетках MDA-MB-231 при супрессии бета-актина. Подавление гамма-актина в MCF-7, напротив, сопровождалось снижением популяции G2/M клеток и увеличением G0/G1 популяции, при этом все клетки культуры были диплоидными. В митотических клетках MCF-7 снижение бета-актина методом миРНК вызывало накопление клеток в профазе/метафазе митоза по сравнению с контролем. Подавление гамма-актина индуцировало блок в телофазе в популяции митотических клеток. В клетках фибросаркомы человека HT1080 мы наблюдали реорганизацию бета-актинового цитоскелета, подавление пролиферации и образование популяции многоядерных клеток в ответ на снижение митохондриальных активных форм кислорода. Наблюдаемые эффекты, по крайней мере частично, были вызваны снижением активности киназ семейства Aurora. Различное воздействие супрессии немышечных актинов на клеточный цикл определили направление дальнейшей работы. Основной интерес для нас представляли первичные циклины (A, B1, D1, D3 и E), которые играют ключевую роль в регуляции клеточного цикла. Впервые было обнаружено, что подавление бета-актина стимулирует экспрессию циклинов A2, B1 и D3, тогда как подавление гамма-актина снижает экспрессию этих циклинов в клетках рака молочной железы. Снижение бета-актина вызывало активацию киназы ERK1/2, уменьшение уровня γ-актина, напротив, приводило к инактивации ERK1/2. Также было обнаружено прямое взаимодействие ERK1/2 с γ-актином и циклином А2 в общем белковом комплексе. Мы предполагаем, что снижение уровня γ-актина приводит к снижению уровня циклина А2, ингибирует передачу сигналов ERK1/2 и замедляет пролиферацию клеток рака молочной железы. По результатам работы был подготовлен доклад «Divergent impact of actin isoforms on cell cycle regulation», представленный на международной конференции «FEBS ADVANCED LECTURE COURSE 2018 - BIOLOGY AND PATHOLOGY OF CYTOSKELETON: THE CROSSROADS OF THREE CYTOSKELETAL SYSTEMS» (20-24 сентября 2018, Прага, Чехия). Полученные в ходе Проекта данные вошли в опубликованные статьи (Журнал Cell Cycle, doi: 10.1080/15384101.2018.1553337; doi: 10.1080/15384101.2018.1496748)