ИСТИНА

В последние десятилетия достигнут значительный прогресс в понимании механизмов трансформации энергии в дыхательной цепи митохондрий и бактерий. Так, для многих ферментов электрон-транспортной цепи (таких как Н+-транслоцирующая NADH:хинон оксидоредуктаза (комплекс I), bc1-комплекс (комплекс III), цитохром-с-оксидаза (комплекс IV), нитратредуктаза и формиатдегидрогеназа) известна трехмерная структура. Более того, для этих ферментов выяснена последовательность окислительно-восстановительных реакций в катализе, а для некоторых ферментов даже и основы механизма генерации ими протонного потенциала. Однако детальный молекулярный механизм преобразования энергии сейчас известен лишь для ферментов, работающих по принципу редокс-петли. Принципы функционирования протонных помп остаются малоисследованными, что представляет одну из главных проблем современной биоэнергетики. Данный проект направлен на решение этой проблемы на примере бактериальных терминальных оксидаз aa3- и bd-типов, Na+-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы и ее аналогов, а также H+- и Na+-транслоцирующей пирофосфатазы. Определение механизма активного транспорта протонов в значительной степени осложнено невозможностью различить протоны, участвующие в окислительно-восстановительных или гидролитических реакциях, и протоны, переносимые через мембрану. Имея это в виду, мы планируем исследовать не только протонные, но и натриевые помпы, в частности, Na+-транслоцирующую NADH:хинон-оксидоредуктазу и родственные ей ферменты, а также Na+-транслоцирующую пирофосфатазу. В этих случаях представляется уникальная возможность отделить трансмембранную транслокацию иона от протон-зависимой окислительно-восстановительной или гидролитической «химии» процесса. Так, можно исследовать каталитический цикл натрий-зависимого фермента при лимитировании его скорости низкими концентрациями Na+ и выявить в нем стадии, специфически ускоряющиеся этими ионами. Такой подход позволяет определить, какие именно окислительно-восстановительные переходы (в случае оксидоредуктаз) или стадии гидролиза субстрата (в случае гидролаз) в ферменте сопряжены с транслокацией Na+. С другой стороны, анализ влияния концентрации Na+ на термодинамические свойства натриевой помпы (или влияние окислительно-восстановительного потенциала на параметры связывания Na+) позволяет установить механизм преобразования энергии редокс-реакции в трансмембранный натриевый потенциал. В предлагаемом проекте мы планируем исследовать бактериальные Na+-транслоцирующую NADH:хинон-оксидоредуктазу (NQR) и Na+-транслоцирующую ферредоксин:NAD+-оксидоредуктазу (RNF). Мембранная пирофосфатаза интересна в этой связи «пластичностью» своей транспортной функции: она представлена тремя гомологичными семействами, одно из которых транспортирует только протоны, а два других – и протоны и Na+, причем, по крайней мере, для одного семейства двойная ионная специфичность является физиологически значимой.

A significant progress has been achieved in the last decades in our understanding of the mechanisms underlying energy transformations in the respiratory chains of mitochondria and bacteria. The 3D structures have been determined for many electron transport chain enzymes, including H+-translocating NADH:quinone oxidoreductase (Complex I), bc1 complex (Complex III) cytochrome c oxidase (Complex IV), nitrate reductase, and formate dehydrogenase. Moreover, the sequences of the redox reactions in these enzymes and, in some cases, the mechanisms of proton potential formation have become clear. However, the molecular details of energy conversion are only known for the enzymes with a redox-loop mechanism, whereas the proton pumps remain largely unexplored in this aspect and represent the major challenge for the contemporary bioenergetics. The current project addresses this problem in studies of bacterial aa3 and bd oxidases, Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase, and Na+-translocating pyrophosphatase. Studies of the mechanisms of active proton transport is severely complicated by the inability to distinguish between the protons generated in redox or hydrolysis reactions and the protons that cross the membrane. We therefore plan to study also sodium pumps, namely, Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase and related enzymes, and Na+-translocating pyrophosphatase. These enzymes provide a unique possibility to separate transmembrane ion translocation from the redox or hydrolytic “chemistry”. For instance, exploring the catalytic cycle of a Na+-dependent enzyme under Na+-limiting conditions may yield information on the step(s) specifically accelerated by Na+ and therefore find candidates for the step coupled with Na+ transfer. Furthermore, Na+ concentration dependence of the sodium pump thermodynamics or the redox potential dependence of Na+ binding may shed light on the mechanism of redox energy conversion into Na+ potential gradient. The current project involves studies of bacterial Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase (NQR) and Na+-translocating ferredoxin:NAD+ oxidoreductase (RNF), as well as Na+-translocating pyrophosphatase. The latter enzyme is interesting because of its transport “plasticity”  one of its three subfamilies transports only H+ whereas the other two transport both H+ and Na+, the dual specificity being physiologically significant for one of the subfamilies.

1. Клонировать ген флаводоксина из Chl. phaeovibrioides, провести экспрессию этого гена в клетках E. coli и выделить рекомбинантный белок с помощью аффинной хроматографии. 2. Установить кинетические параметры восстановления полученного флаводоксина реакционным центром Chl. phaeovibrioides, а также возможность его участия в передаче электронов от реакционного центра к пируват:ферредоксин оксидоредуктазе этого микроорганизма. 3. Методом окислительно-восстановительного титрования определить значения среднеточечных потенциалов для переходов хинон/семхинон и семхинон/гидрохинон в флаводоксине из Chl. phaeovibrioides. 4. Методом сайт-направленного мутагенеза получить мутантные формы A. vinelandii по различным NADH:хинон-оксидоредуктазам дыхательной цепи. 5. На мембранных препаратах из полученных мутантов определить субстратную специфичность NQR из A. vinelandii. 6. Получить мембранные препараты (субклеточные везикулы) клеток E. coli штамма GO105/pTK1 с цитохромом bd-I в качестве единственной терминальной оксидазы, гомогенные препараты солюбилизированного цитохрома bd-I E. coli и протеолипосы со встроенным цитохромом bd-I. 7. Получить гомогенные препараты дикого типа и мутантных форм D132N, N139D и E286D с заменами в D-канале очищенной цитохромоксидазы аа3 из Rhodobacter sphaeroides. 8. Подобрать оптимальные условия и разработать методику измерения быстрой кинетики переноса электрона через гемовые центры цитохромокосидаз семейства А, в условиях одноэлектронной инъекции в отдельные состояния каталитического цикла, с регистрацией спектров в видимой области с микросекундным временным разрешением. 9. Определить влияние мутации D132N во входном участке D-канала цитохромоксидазы аа3-типа из R. sphaeroides на кинетику генерации мембранного потенциала и электрогенные стадии транслокации протонов и кинетику переноса электронов через гемовые центры ферментов. 10. Определить влияние мембранного окружения на способность цитохрома bd-I в составе мембранных везикул, мицелл детергента или протеолипосом связывать цианид и СО. 11. Определить константы скорости четырех элементарных стадий в катализе CBS-пирофосфатазой. 12. Провести измерения и анализ кинетики ингибирования мембранной пирофосфатазы в составе мембранных везикул аналогом субстрата аминометилендифосфонатом.

Нашим коллективом накоплен большой опыт в исследовании энергопреобразующих ферментов бактерий с использованием современных биохимических и биофизических методов и подходов. В работах последних лет, посвященных Na+-транслоцирующей NADH:хинон-оксидоредуктазе, разработан метод выделения этого фермента из V. harveyi, показана генерация градиента pH и трансмембранной разности электрического потенциала данным белком на реконструированной системе (Zhou et al., 1999), обнаружено наличие в нем ковалентно присоединенного остатка FMN (Zhou et al., 1999), определена стехиометрия Na+/e- (Bogachev et al., 1997), методами ЭПР- и оптической спектроскопии с использованием техники быстрого смешивания идентифицирована стадия каталитического акта NQR, сопряженная с трансмембранной транслокацией иона натрия (Bogachev et al., 2001, Bogachev et al., 2009a), проведено полное электрохимическое титрование данного белка (Bogachev et al., 2009c, Bogachev et al., 2009b), обнаружено значительное изменение межспинового расстояния между радикалами FMNNqrB и FMNNqrC при связывании ионов Na+ (Verkhovsky et al., 2012). Полный оперон nqr из V. harveyi клонирован и гетерологически экспрессирован с хорошим выходом активного рекомбинантного белка, который выделен в чистом виде с помощью аффинной хроматографии. Налажен сайт-специфический мутагенез (Фадеева et al., 2008). Охарактеризована регуляция экспрессии nqr-оперонов у различных микроорганизмов (Fadeeva et al., 2007). Кроме того, открыт новый фермент (флавинтрансфераза), катализирующий ковалентное присоединение FMN к NQR (Bertsova et al., 2013) и показано, что он может входить в состав белков как домен (Serebryakova et al., 2018).

1. Получен и охарактеризован флаводоксин зеленой серной бактерии Chlorobium phaeovibrioides Ген зеленой серной бактерии Chl. phaeovibrioides был гетерологически экспрессирован в клетках Escherichia coli, что позволило наработать кодируемый им белок Fld и установить его функциональное сходство с типичными флаводоксинами. Fld, а также все известные флаводоксины содержат нековалентно связанный FMN в качестве единственной простетической группы. Так же, как и у всех известных флаводоксинов этот остаток FMN может быть восстановлен в Fld в результате двух последовательных одноэлектронных переходов: хинон→семихинон и семихинон→хинол. Значения Em для этих двух переходов сильно различаются, т.е. в Fld наблюдается эффективная стабилизация радикального состояния флавина. Наряду с общими для флаводоксинов свойствами, Fld проявляет также ряд необычных свойств, отличающих его от остальных белков этого класса. Прежде всего – это уникальная устойчивость семихинонового состояния Fld к окислению кислородом воздуха. Все известные на сегодняшний день флаводоксины выделяются в полностью окисленной (хинонной) форме, тогда как Fld – в виде нейтрального семихинона. Эту нестабильную форму радикала флавина, существование которой доказано косвенными методами, называют «синий флавиновый радикал». Свежевыделенный Fld предоставил редкую возможность оценить справедливость этого названия визуально. Еще одной особенностью Fld, отличающей его от большинства других флаводоксинов, является значение Em для перехода семихинон/хинол — примерно –530 мВ. В известных флаводоксинах значение этого перехода обычно лежит в диапазоне от –370 до –480 мВ. По-видимому, столь низкое значение Em для перехода семихинон/хинол в Fld оптимально для протекания пируват:ферредоксин-оксидоредуктазной (PFOR) реакции в направлении синтеза пирувата, что соответствует физиологической потребности клеток зеленых серных бактерий при проведении восстановительного цикла Кребса. Даже в оптимальных для протекания PFOR-реакции условиях (высокая концентрация пирувата и CoA, низкая концентрация ацетил-CoA) пул Fld(sq) может быть восстановлен лишь приблизительно на 1/6 своей величины из-за более низкого значения Em пары Fld(sq)/Fld(red) по сравнению с парой (пируват + CoA)/(ацетил-CoA + CO2). По-видимому, Fld заменяет в клетках зеленых серных бактерий ферредоксин при лимитировании роста этих микроорганизмов доступностью железа. Наряду с обнаруженной способностью Fld эффективно взаимодействовать с реакционным центром и PFOR в Chl. phaeovibrioides, на это указывает также геномный контекстный анализ и индукция экспрессии гена Fld при понижении содержания железа в среде роста. Флаводоксин из Chl. phaeovibrioides является первым описанным на сегодняшний день белком этого класса из зеленых серных бактерий. Простота наработки этого белка, его высокая стабильность и уникальная особенность выделяться в семихинонном состоянии делает этот белок идеальным объектом для исследования ферментов, требующих низкопотенциальных доноров электронов для осуществления ферментативной активности. Это и было использовано в данном проекте при работе с ферредоксин:NAD+-оксидоредуктазой (RNF, см. ниже). 2. Обнаружена Na+-транслоцирующая ферредоксин(флаводоксин):NAD+-оксидоредуктаза (RNF) в фотосинтезирующей бактерии Chl. phaeovibrioides Поиск генов rnf-оперона, кодирующего Na+-транслоцирующую ферредоксин:NAD+-оксидоредуктазу (RNF), среди фотоавтотрофных организмов с фотоcинтетическими реакционными центрами типа I показал, что rnf-гены отсутствуют у гелиобактерий, цианобактерий и растений. Однако, rnf-оперон присутствует в геномах многих, хотя и не всех, зеленых серных бактерий. Присутствие rnf-оперона характерно, прежде всего, для морских представителей Chlorobiaceae, в среде обитания которых повышена концентрация Na+. Анализ экспрессии rnf-генов выявил относительно высокий уровень содержания транскриптов этих генов в препаратах РНК, выделенных из морской зеленой серной бактерии Chl. phaeovibrioides, то есть показал, что они не являются “молчащими” генами или псевдогенами. Измерение ферредоксин:NAD+-оксидоредуктазной (FNO) активности во фракциях клеток Chl. phaeovibrioides показало наличие у этой бактерии, по крайней мере, двух различных Fld(red):NAD+-оксидоредуктаз. Одна из них была обнаружена в цитоплазматической фракции, и ее активность не стимулировалась увеличением концентрации Na+. Вторая Fld(red):NAD+-оксидоредуктаза ассоциирована с мембранами, и она специфически активировалась под действием Na+. В клетках близкородственной пресноводной зеленой серной бактерии Cba. limnaeum, чей геном не содержит rnf-оперона, обнаружена лишь Na+-независимая цитоплазматическая Fldred:NAD+-оксидоредуктаза. Na+-независимая цитоплазматическая FNO-активность, по-видимому, осуществляется водорастворимой ферредоксин-NAD(P)+ редуктазой (FNR), ген которой присутствует в геномах Chl. phaeovibrioides (GenBank ID: ABP37348) и Cba. limnaeum (AOS83202). Так как вторая FNO-активность, обнаруживаемая в мембранной фракции Chl. phaeovibrioides, (i) специфически стимулируется ионами Na+, (ii) осуществляется мембраносвязанным ферментом и (iii) отсутствует у Cba. limnaeum, можно заключить, что эта активность принадлежит RNF. Следовательно, in vivo поток электронов фотосинтетической электрон-транспортной цепи частично проходит через RNF, что позволяет дополнительно запасти энергию в форме трансмембранной разности потенциалов иона Na+. Таким образом, Chl. phaeovibrioides является первым примером использования Na+-энергетики в фотосинтетических электрон-транспортных цепях. 3. Определена катионная специфичность и роль NADН:хинон-оксидоредуктазы (гомолога NQR) из Azotobacter vinelandii В связи с противоречивым характером литературных данных о транспортной специфичности (Н+ или Na+?) одной из трех NADH:хинон-оксидоредуктаз A. vinelandii (NQR) были детально определены ион-транслоцирующие свойства дыхательной цепи. Было обнаружено, что ферментативная активность NQR из этой бактерии специфически ускоряется ионами Na+ и Li+, но эти эффекты наблюдались в субмиллимолярном диапазоне концентраций этих ионов. Необычно низкие значения Km для Na+ и Li+, не характерные для известных NQR, и явились причиной ошибочного отнесения NQR A. vinelandii к протонным помпам, поскольку примесной концентрации Na+ в среде оказалось достаточно для активации этого Na-зависимого фермента. Это свойство NQR хорошо согласуется с физиологическими потребностями A. vinelandii, которая живет в почве с низким содержанием Na+. Способность NQR из A. vinelandii к трансмембранному переносу Na+ была подтверждена с помощью измерения двух характеристик – Δψ и ΔpH. Показано, что Δψ, формируемый NQR в присутствии Na+, частично устойчив к действию протонофора CCCP. Также продемонстрировано, что активность NQR сопровождается CCCP-стимулируемой генерацией обращенной ΔpH (защелачивание внутри вывернутых мембранных везикул). Этот подход, который предложен в нашей публикации как универсальный для селективной идентификации Н+- и Na+-насосов позволил доказать, что NQR A. vinelandii, как и другие ферменты этого класса, является первичной Na+-помпой. Измерение генерации ΔpH по флуоресценции пиранина или акридинового оранжевого подтвердили, что этот фермент не способен к переносу H+. Параллельное исследование NADH:хинон-оксидоредуктазы NDH-1 дыхательной цепи A. vinelandii показала, что (i) каталитическая активность этого белка не активируется моновалентными катионами; (ii) формируемый NDH-1 Δψ полностью рассеивается в присутствии CCCP; (iii) ферментативная активность NDH-1 сопровождается не защелачиванием, а закислением внутреннего объема вывернутых мембранных везикул, и данный процесс является полностью CCCP-чувствительным. Все эти свойства находятся в хорошем соответствии с тем, что NDH-1 из A. vinelandii, так же, как и другие исследованные ферменты этого класса, является первичной H+-помпой. Были определены ростовые характеристики мутантных штаммов A. vinelandii с инактивированными NADH:хинон-оксидоредуктазами дыхательной цепи (NDH-1, NQR и NDH-2). В присутствии связанного азота скорость роста четырех штаммов (включая дикий тип) была практически одинакова, что показало возможность взаимозаменяемости NADH:хинон-оксидоредуктаз. В диазотрофных условиях штамм с инактивированной NQR был способен к росту, но демонстрировал намного более продолжительный лаг-период и значительно меньшую скорость роста по сравнению со штаммами дикого типа. Это наблюдение свидетельствует о важности NQR и натриевого потенциала для диазотрофного роста этой бактерии. 4. Идентифицированы два белка, необходимые для созревания RNF A. vinelandii С помощью сайт-направленного мутагенеза установлено участие флавинтрансферазы ApbE в флавинилировании RNF-комплекса A. vinelandii, а также вовлеченности ApbE в процесс азотофиксации у этой бактерии. Поскольку ген apbE расположен на хромосоме A. vinelandii в непосредственной близости от nqr-оперона и на большом расстоянии от оперонов rnf1 и rnf2 возможность полярного эффекта мутации по apbE на rnf-опероны исключена. Показано, что произведенная мутация приводит к исчезновению основных флавинилированных белков с электрофоретической подвижностью, ожидаемой для субъединиц RNF- и NQR-комплексов в мембранной фракции клеток A. vinelandii. Кроме того, мутация по apbE приводила к существенному снижению ферментативной FNO-активности, а при инактивации FixABCX комплекса – к ее полному исчезновению. По ростовым характеристикам мутантные по apbE штаммы A. vinelandii похожи на описанные штаммы с инактивированными RNF-комплексами [Curatti et al., 2005; Ledbetter et al., 2017]. Влияние apbE-мутации на диазотрофный рост A. vinelandii не может быть объяснено инактивацией NQR-комплекса, в состав которого также входят флавинилированные субъединицы, т.к. мутантный по nqr штамм A. vinelandii не демонстрировал столь выраженный ростовой дефект. Таким образом, совокупность полученных данных свидетельствует, что флавинтрансфераза ApbE вовлечена в флавинилирование субъединиц RNF-комплекса A. vinelandii. Этот вывод прямо подтвержден флавинилированием субъединицы RnfG1 при коэкспрессии ее гена с геном apbE в клетках E. coli. Для идентификации сайта флавинилирования в RNF сконструирован укороченный цитоплазматический вариант субъединицы G RNF-комплекса 1 из Azotobacter vinelandii с удаленной трансмембранной α-спиралью этого белка (RnfG1'). Такой белок имел спектральные свойства (максимумы поглощения при 384 и 457 нм), характерные для флавопротеинов. На неокрашенных электрофореграммах полоса holoRnfG1', выделенного из ApbE-содержащих клеток E. coli, демонстрировала выраженную флуоресценцию при возбуждении светом с λ = 473 нм. Масс-спектрометрический анализ триптических пептидов апо- и холоформ этого белка идентифицировал остаток Thr202 как место ковалентного присоединения остатка FMN. С помощью биоинформатических подходов в геномах бактерий обнаружен ген rseC (mucC), кодирующий белок с неизвестной функцией и генетически сцепленный с генами комплекса RNF. Ген rseC присутствует лишь в геномах бактерий, содержащих RNF, и, наоборот, большинство RNF-содержащих бактерий содержат rseC. Белковый продукт RseC очень похож на белок NqrM – фактор созревания близкородственного фермента Na+-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы. Все это делает RseC хорошим кандидатом на роль белка, участвующего в процессе созревания RNF-комплекса. Показано, что мутация по гену rseC приводит к существенному снижению флаводоксин:NAD+-оксидоредуктазной активности мембранных везикул A. vinelandii, но даже на фоне мутации по fix не приводит к ее полному подавлению. Этот результат указывает на то, что RseC вовлечен в созревание RNF-комплексов A. vinelandii, но эта бактерия имеет другой белок, дублирующий функцию RseC. 5. Установлена доминирующая роль RNF в восстановление низкопотенциальных переносчиков электронов у A. vinelandii Согласно нашим данным, бактерия A. vinelandii является редким исключением из общего правила, согласно которому азотофиксирующие бактерии используют один из двух путей генерации восстановленных форм низкопотенциальных переносчиков восстановительных эквивалентов (ферредоксина и флаводоксина) за счет NADH в качестве источника электронов. Первый из них (использующий RNF комплекс) основан на обратном транспорте электронов против градиента редокс-потенциала за счет трансмембранной разности натриевых потенциалов. Второй способ (использующий FixABCX комплекс) заключается в восстановлении флаводоксина (ферредоксина) за счет эндотермического переноса электрона с NADH (Em ≈ –320 мВ) на флаводоксин (Em ≈ –500 мВ), сопряженного с экзотермическим переносом электрона с NADH на убихинон (Em = +110 мВ). Мы обнаружили, что в A. vinelandii реализованы оба пути. Полученные мутантные штаммы A. vinelandii (ΔApbE, ΔFix и ΔFix/ΔApbE) позволили оценить вклад двух путей в восстановления флаводоксина (ферредоксина). Одиночные мутации не приводили к полному исчезновению FNO-активности или полному подавлению диазотрофного роста, что указывает на то, что отсутствие активности RNF или FixABCX может быть компенсирована активностью второго белка. Мутация по apbE, вызывавшая инактивацию RNF комплексов, приводила к большему изменению FNO-активности и намного более выраженному фенотипу в диазотрофных условиях по сравнению с fix-мутацией, что указывает на ведущую роль RNF в восстановлении низкопотенциальных переносчиков электронов в клетках A. vinelandii. 6. Описана новая цитоплазматическая NADH:фумарат-оксидоредуктаза в Klebsiella pneumoniae Описанная ранее мономерная фумаратредуктаза Klebsiella pneumoniae (FRD) образована тремя доменами и содержит три простетические группы: нековалентно связанные FMN и FAD, а также ковалентно связанный FMN. Мы установили, что физиологическим донором электронов для этого фермента является NADH, который, по всей видимости, окисляется OYE-like-доменом с нековалентно связанным FMN. Ранее обнаружение этого факта затрудняли низкая скорость окисления NADH, узкий pH-оптимум активности фермента и чувствительность FRD к кислороду. Несмотря на низкую скорость окисления NADH (≤ 10 с-1), ряд наблюдений позволяет утверждать, что эта активность не является артефактной: (i) высокая NADH/NADPH селективность, характерная для большинства природных NAD(P)H дегидрогеназ; (ii) чрезвычайно высокий уровень удельной метилвиологен:фумарат-оксидоредуктазной активности FRD в клетках K. pneumoniae (~3 мкмоль/мин/мг) и характерный для других NADH-дегидрогеназ этой бактерии уровень NADH:фумарат-оксидоредуктазной активности (~60 нмоль/мин/мг); (iii) близкие величины удельной NADH:фумарат-оксидоредуктазной активности изолированного FRD K. pneumoniae и подобных ферментов, например, FRD кинетопластид. Установлено, что скорость оборота фермента в NADH:фумарат-оксидоредуктазной реакции лимитирована низкой скоростью переноса электронов между нековалентно и ковалентно связанными молекулами FMN. Индукция синтеза FRD в клетках K. pneumoniae наблюдается только в анаэробных условиях в присутствии фумарата (малата). Белки с FRD-подобной доменной архитектурой широко распространены среди геномов разнообразных бактерий и, вероятно, представляют собой такие же водорастворимые NADH:фумарат-оксидоредуктазы. 7. Определено влияние мутаций в протон-проводящем D-канале цитохромоксидазы аа3-типа на быструю кинетику переноса зарядов Разрешена и исследована в режиме одного оборота фермента быстрая кинетика переноса электрона через редокс-центры цитохромоксидазы аа3 из Rhodobacter sphaeroides дикого типа и мутантных форм с одиночными заменами D132N, N139D, E286D в протон-проводящем D-канале. Выяснены и охарактеризованы спектрально-кинетические параметры восстановления низко-спинового гема а от CuA, а также переноса электрона от гема а в каталитический центр в режиме одного оборота ферментов дикого типа и мутантных форм. Получены количественные оценки эффектов мутаций: замедление частных стадий переноса электронов (E286D), уменьшение амплитуды либо полное ингибирование части компонент быстрого реокисления гема а каталитическим центром (D132N, N139D), появление фракций неэффективного ("дезактивированного") окисленного состояния каталитического центра (D132N, N139D), изменение относительных вкладов гемов а и а3 в спектры компонент реокисления гема а каталитическим центром (E286D). Проведен сравнительный анализ кинетики переноса электронов через гемовые центры и электрогенных стадий переноса зарядов и генерации мембранного потенциала цитохромоксидазы аа3 из R. sphaeroides с мутациями D132N и N139D во входном протонном D-канале. Получены количественные оценки эффектов мутаций D132N, N139D на амплитуду и временные характеристики сопряженного перемещения зарядов в ходе каталитического цикла цитохромоксидазы. Определены скорость и расcстояние электрогенного переноса протона в мутанах D132N и N139D при протонировании кислородного атома в активном центре. Расшифрован механизм генерации мембранного потенциала в мутантных оксидазах, сохраняющей частично (D132N) и полностью (N139D) скорость кислород-редуктазной активности на фоне ингибирования трансмембранной перекачки протонов. Выявлены неактивные фракции мутантных ферментов D132N и N139D и определены спектральные характеристики и состояние каталитического центра в этих фракциях (дезактивированное окисленное состояние). Данное окисленное состояние в мутантах D132N и N139D не способно как к перекачиванию протонов через мембрану, так и к переносу субстратного протона из внутренней водной фазы при одноэлектронном восстановлении фермента. Этим оно отличается от неактивированного окисленного состояния O фермента дикого типа, которое восстанавливается сопряженно с переносом субстратного протона в активный центр из внутренней водной фазы. Для мутанта E286D выявлены значительные отличия спектров компонент реокисления гема а каталитическим центром по сравнению с ферментом дикого типа. Оба переходных процесса отражают реокисление гема а, однако вклад спектральных изменений гема а3 в более медленную стадию значительно больше. Это указывает на то, что в ходе первой фазы реокисления гема а происходит перенос электрона от гема а на промежуточный акцептор электрона, спектральные характеристики которого не совпадают с таковыми для восстановления гема а3. Возможным промежуточным акцептором электрона является атом меди редокс-центра CuB либо остаток тирозина, ковалентно связанный с одним из гистидиновых лигандов CuB. Данный процесс, по-видимому, имеет место и в случае фермента дикого типа, но не разрешается вследствие большей константы переноса электрона от промежуточного акцептора на гем а3. Мутант E286D сохраняет способность к перекачке протонов через мембрану в стационарных измерениях. Поэтому наблюдающееся замедление восстановление гема а3 относительно реокисления гема а в предстационарном измерении указывает на промежуточную стадию переноса электрона от гема а к промежуточному акцептору, восстановление и последующее реокисление которого гемом а3 может иметь непосредственное отношение к сопярженной транслокации перекачиваемого протона в механизме перекачки протона через мембрану, происходящей до попадания субстратного протона в каталитический центр и восстановления в нем кислородного атома гема а3. 8. Спектрально и кинетически охарактеризовано взаимодействие терминальных оксидаз типа bd с окисью углерода и цианидом Получены препараты цитохрома bd-I Escherichia в составе субклеточных везикул и протеолипосом, а также в изолированном виде, и получены параметры связывания им цианида и СО в разном липидном окружении. Обнаружено, что при солюбилизации цитохрома bd-I в нем появляются дополнительные центры связывания, скорее всего, гем типа b. Встраивание изолированного цитохрома bd-I в азолектиновые липосомы восстанавливало лиганд-связывающие свойства, проявляемые ферментом в природной мембране. Получен препарат солюбилизированного цитохрома bd Geobacillus thermodenitrificans и проведен анализ его основных каталитических и спектральных свойств в стационарных условиях. Определено, что константа диссоциации комплекса гема d с СО в полностью восстановленном цитохроме bd составляет 630 нМ. По разностным спектрам фотолиза и кинетическим фазам рекомбинации гема d солюбилизированного полностью восстановленного цитохрома bd G. thermodenitrificans с СО определено, что константа скорости рекомбинации равна 5 × 10(7) M-1×c-1. 9. Обнаружена функциональная и структурная неэквивалентность субъединиц мембранной пирофосфатазы Обнаружена неэвивалентность активных центров гомодимерной мембранной H+-пирофосфатазы из D. hafniense в связывании пирофосфата и его трех негидролизуемых аналогов, содержащих атомы N или C вместо O в мостиковом положении. Асимметрия проявляется в том, что (а) молекула субстрата присоединяется гораздо прочнее к свободному ферменту, чем к ферменту, в одном активном центре которого уже есть субстрат или его аналог; (б) молекула аналога субстрата присоединяется гораздо прочнее к свободному ферменту, чем к ферменту, в одном активном центре которого уже есть субстрат или его аналог; (в) активность фермента снижается при связывании субстрата или его аналога во втором центре. Показано, что неэквивалентность субъединиц в связывании субстрата, но не в его превращении, уменьшается до полного исчезновения при уменьшении концентрации металла-кофактора Mg2+. Анализ траекторий и усредненных структур полученных методом молекулярной динамики моделей свободной мембранной Н+-пирофосфатазы и содержащей имидодифосфат в одном или двух активных центрах выявил сильную структурную взаимозависимость субъединиц. Она состоит в том, что наибольший структурный эффект связывание имидодифосфата вызывает в вакантной соседней субъединице. Наибольшие изменения наблюдаются в структурах внутривакуолярной петли, соединяющей α-спирали 2 и 3, и α-спирали 12. Обнаружено, что петля 2-3 высококонсервативна, имеет жесткую структуру, принимает в зависимости от состояния соседней субъединицы одну из двух дискретных конформаций и встречается только в вакуолярных пирофосфатазах растений. Методом виртуальной мутации идентифицированы контактные аминокислотные остатки, определяющие конформацию петли и связывающие ее через α-спираль 12 с активным центром соседней субъединицы. Предложенный на основании этих данных механизм транспорта мембранной пирофосфатазы, является гибридом гипотетического механизма «прямого сопряжения» Митчелла, согласно которому транспортируемый протон является непосредственным продуктом химической реакции, с «роторным» механизмом работы протонной АТРазы Бойера, согласно которому транспорт осуществляется за счет энергии, аккумулированной в соседних субъединицах. Этот механизм уникален для мембранной пирофосфатазы, поскольку ни один другой из известных переносчиков протонов не работает по принципу «прямого сопряжения». 10. Определены скорость-лимитирующая стадия и изотопные эффекты в катализе мембранной пирофосфатазой Методом «quenched-flow» измерена предстационарная кинетика накопления продукта реакции (фосфата) при работе термостабильной Na+-пирофосфатазы Thermotoga maritima. Накопление фосфата при насыщающей концентрации субстрата происходит линейно, без «всплеска» или «лаг-периода», что позволило идентифицировать стадию гидролиза как скорость-лимитирующую. Проведенный на основании этого вывода пересмотр данных литературы показал, что транспорт протона Н+-пирофосфатазой растения Vigna radiata происходит синхронно с гидролизом связанного пирофосфата в одном обороте фермента. Это позволяет отвергнуть продвигаемый группой А. Голдмана (Университет г. Лид, Великобритания) механизм протонного транспорта, согласно которому он происходит в результате связывания субстрата, до его гидролиза. Скорость-лимитирующая стадия катализа гидролиза (и, следовательно, транспорта) замедляется при замене Н2О на D2O в реакционной среде. Величины изотопного эффекта для двух Na+-транспортирующих, Н+-транспортирующей и Na+,H+-транспортирующей пирофосфатаз были практически одинаковыми и составили 0,66-0,72. Это означает, что на скорость-лимитирующей стадии катализа происходит перенос одного протона. Эти данные свидетельствуют в пользу предлагаемой нами «биллиардной модели» транспорта натрия, согласно которой выделяющийся при гидролизе протон толкает ион натрия, связанный на входе в ион-транспортирующий канал, внутрь канала. Эта модель применима и к транспорту протона. 11. Четвертичная структура CBS-пирофосфатазы и принцип действия регуляторного центра Установлена тетрамерная структура CBS-пирофосфатазы из Desulfitobacter hafniense, что отличает ее от димерной канонической пирофосфатазы семейства II, не имеющей регуляторных CBS-доменов. Установлена также димерная структура ее отдельно продуцированных каталитической и регуляторной частей CBS-пирофосфатазы. Обнаружено, что природный лиганды CBS-пирофосфатазы (субстрат, металл-кофактор Со2+, адениновые нуклеотиды) стабилизируют ее тетрамерную структуру. Предложена модель структуры тетрамера с «перекрестным» взаимодействием пар субъединиц через каталитические домены DHH и регуляторные CBS-домены. Найдено, что CBS-пирофосфатаза Ethanoligenens harbinense, в которой в результате природной мутации нарушен регуляторный центр с потерей способности связывать адениновые нуклеотиды, по каталитическим свойствам мало отличается от «канонических» пирофосфатазам, у которых регуляторные CBS-домены вообще отсутствуют. Это подтвердило гипотезу о том, что регуляторные CBS-домены являются внутренним ингибитором, действие которого усиливается или ослабевает связанными нуклеотидами. Обнаружен новый природный ингибитор CBS-РРаз – аденозинфосфосульфат (APS), являющийся структурным аналогом ADP. 12. Синтетазная активность регулируемой нуклеотидами растворимой CBS-пирофосфатазы С помощью сопряженной ферментной системы АТР-сульфурилаза/люцифераза для люминисцентного определения пирофосфата измерена кинетика синтеза пирофосфата CBS-пирофосфатазы D. hafniensee в растворе. Анализ этих данных показал, что хотя равновесие реакции синтеза пирофосфата из фосфата в растворе сильно смещено в сторону фосфата, начальные скорости синтеза можно было измерить за счет того, что избыток АТР-сульфурилазы позволяет поддерживать стационарную концентрацию пирофосфата намного ниже равновесной. Скорость синтеза линейно зависела от второй или большей степени концентрации фосфата. Это означает, что необходимые для синтеза две молекулы фосфата связываются с высокой положительной кооперативностью и их сродство к ферменту невелико. Клеточный алармон диаденозинтетрафосфат ускорял синтез на два порядка. Данные по синтезу связанного с белком пирофосфата в состоянии равновесия показали, что ингибитор АМР стимулирует синтез связанного пирофосфата. Диаденозинтетрафосфат увеличивает синтетазную активность CBS-пирофосфатазы примерно в 300 раз, т.е. на две порядка больше, чем гидролазную (в 1,6 раза). Константа скорости k-1 стадии выброса пирофосфата из комплекса с ферментом существенно ниже для CBS-пирофосфатазы в отсутствие нуклеотидов-эффекторов, чем для канонической пирофосфатазы, не имеющей регуляторных CBS-доменов. Это, а также восстановление синтетазной активности под действием Ар4А согласуется с гипотезой о роли CBS-доменов как «внутренних ингибиторов».