![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Эпигенетические исследования призваны установить молекулярные механизмы включения/ выключения генов и адаптивной регуляции функции генома. Особо актуальными являются эпигенетические исследования регуляции генов, продукты которых вовлечены в патогенез различных, и, в частности, онкологических заболеваний. Новым этапом развития медицинской генетики является формирование эпигенетического подхода, в котором геном описывается как динамичная программа, реализуемая в условиях строго упорядоченных регуляторных взаимоотношений между генами и их продуктами (РНК, белками, надмолекулярными структурами). В связи с этим задачей данного проекта является исследование на молекулярном уровне эпигенетических механизмов, лежащих в основе возникновения и развития онкологических заболеваний, с перспективами разработки новых подходов к диагностике онкологических заболеваний и идентификации новых мишеней для разработки противораковых препаратов следующего поколения. Планируемые исследования направлены на анализ эпигенетической регуляции транскрипции генов фактором FACT, а также онкосупрессором р53, который также взаимодействует с ДНК в хроматине. Новизна проекта определяется постановкой актуальных и практически значимых задач, нацеленных на установление особенностей взаимодействия факторов FACT и р53 с нуклеосомами, т.е. структурами которые потенциально способны модулировать активацию генов, включая те, которые связаны с развитием патологий. В рамках проекта взаимодействия р53 и FACT с хроматином будут охарактеризованы как со структурной (влияние на структуру нуклеосом), так и с функциональной (влияние на процесс транскрипции) точек зрения. С использованием современных физико-химических методов (микроскопия одиночных частиц и их комплексов на основе Фёрстеровского резонансого переноса энергии (FRET), анализ электрофоретической подвижности в геле, в том числе, с измерением FRET, футпринтинг, методы интегративного моделирования, электронная микроскопия) будет определен механизм действия фактора FACT (дрожжевого и человеческого) на структуру нуклеосом, в том числе в присутствии вариантов гистонов, регуляторных белков и пост-трансляционных модификаций. Будет определен вклад внутренней подвижности нуклеосом в динамику данных процессов и изучены предпосылки активации p53-зависимых генов на уровне нуклеосом. Полученная нами информация о функционировании FACT на молекулярном и нуклеосомном уровне послужит основой для определения механизмов действия потенциальных противоопухолевых препаратов. В данном проекте будет существенно уточнен механизм действия противоопухолевых соединений кураксинов, мишенью которых является FACT, а также изучено влияние нуклеосом-связывающих пептидов в качестве ингибиторов FACT. В ходе решения технических, методических и фундаментальных научных задач по ходу проекта будут существенно усовершенствованы методики микроскопии одиночных частиц и их комплексов на основе FRET для изучения конформационной динамики нуклеосом, а также уточнены динамические модели организации нуклеосом, включая детали внутренней динамики нуклеосом и строения линкерной области. В сотрудничестве с партнером-инвестором результаты проекта будут использованы в качестве основы для последующей разработки оригинальных технологий персонифицированной диагностики и лечения онкологических заболеваний на основе новых открытых молекулярных мишеней.
Epigenetic studies are designed to establish the molecular mechanisms of switching genes on/ off and adaptive regulation of genome function. Particularly relevant are epigenetic studies of gene regulation, the products of which are involved in the pathogenesis of various diseases, and in particular cancer. A new stage in the development of medical genetics is the epigenetic approach, in which the genome is described as a dynamic program implemented in a strictly ordered regulatory relationships between genes and their products (RNA, proteins, supramolecular structures). In this regard, the objective of this project is to study at the molecular level the epigenetic mechanisms underlying the emergence and development of cancer, with the prospects of developing new approaches to the diagnosis of cancer and the identification of new targets for the development of next-generation anticancer drugs. The planned studies are aimed at the analysis of epigenetic regulation of gene transcription by factor FACT, as well as by the p53 tumor suppressor, which also interacts with DNA in chromatin. The novelty of the project is determined by the formulation of actual and practically significant tasks aimed at establishing the features of the interaction of factors FACT and p53 with nucleosomes, i.e. structures that are potentially able to modulate the activation of genes, including those associated with the development of pathologies. Within the framework of the project, the interaction of p53 and FACT with chromatin will be characterized both from structural (influence on the structure of nucleosomes) and from functional (influence on the transcription process) points of view. Using modern physical and chemical methods (microscopy of single particles and their complexes based on the Ferster resonance energy transfer (FRET), analysis of electrophoretic mobility in the gel, including the measurement of FRET, footprinting, methods of integrative modeling, electron microscopy), the mechanism of action of the factor FACT (yeast and human) on the structure of nucleosomes, including action in the presence of variants of histones, regulatory proteins and post-translational modifications will be determined. The contribution of internal mobility of nucleosomes to the dynamics of these processes will be determined and the prerequisites for the activation of p53-dependent genes at the level of nucleosomes will be studied. The obtained information about FACT functioning at the molecular and nucleosomal level will serve as a basis for determining the mechanisms of action of potential anticancer drugs. This project will substantially clarify the mechanism of action of anti-cancer compounds curaxins, targeted at the FACT, and the effect of nucleosomes-binding peptides inhibiting FACT will be studied. In the course of addressing technical, methodical and fundamental scientific problems during the project development will be significantly improved methods of microscopy of single particles and their complexes on the basis of FRET to study the conformational dynamics of nucleosomes, as well as the dynamic model of the organization of nucleosomes, including the details on the internal dynamics of nucleosomes and the structure of the linker region. In cooperation with the investor, the results of the project will be used as a basis for the further development of original technologies for personalized diagnosis and treatment of cancer on the basis of newly discovered molecular targets.
В рамках проекта будут определены молекулярные основы функционирования про-опухолевого фактора FACT и онкосупрессора p53 при эпигенетической регуляции генов в хроматине на уровне нуклеосом и изучены механизмы модуляции активности этих белковых комплексов различными факторами. С использованием методов электронной микроскопии будут определены механизмы действия фактора FACT (дрожжевого и человеческого) и белка р53 на структуру нуклеосом, и выявлены интермедиаты разворачивания нуклеосом фактором FACT. Будет определено влияние ковалентных модификаций и вариантов гистонов, внутренней динамики нуклеосом, регуляторных белков и нуклеосом-связывающих пептидов на взаимодействия FACT c нуклеосомами. Будет изучено влияние вариантного гистона H2A.Z, ацетилированного гистона H3, негистоновых HMGB- содержащих регуляторных белков HMO1 и HMGB1, и нуклеосом-связывающих пептидов на реорганизацию нуклеосом фактором FACT. Будут определены механизмы действия про-опухолевого фактора FACT в процессе транскрипции нуклеосом, а также влияния ковалентных модификаций коровых гистонов и варианта гистона Н2А.Z на этот процесс. Будут детально изучены молекулярные основы действия анти-раковых препаратов кураксинов на разворачивание нуклеосом фактором FACT. Будут получены данные о роли доменов FACT в транскрипции нуклеосом РНК полимеразой 2 и в реорганизации нуклеосом. Будет количественно определена высота нуклеосомного барьера при транскрипции в присутствии различных вариантов фактора FACT. Полученные данные позволят дополнить и детализировать модель действия кураксинов на FACT-опосредованное ремоделирование нуклеосом. Будут выполнены методические разработки, которые позволят существенно повысить аналитические возможности микроскопии одиночных частиц и их комплексов на основе Фёрстеровского резонансого переноса энергии (spFRET микроскопии) применительно к изучению конформационной динамики нуклеосом, а также уточнить динамические модели организации нуклеосом, включая детали внутренней динамики нуклеосом и строения линкерной области. Полученные результаты будут соответствовать мировому уровню. Результаты проекта предполагается использовать в качестве основы для последующей разработки оригинальных технологий для персонифицированной диагностики и лечения онкологических заболеваний на основе новых молекулярных мишеней.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 марта 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний |
Результаты этапа: Разработан дизайн двух ДНК-матриц на основе нуклеосом-позиционирующей последовательности s603-42А, содержащих сайт связывания p53 из промотора CDKN1A, расположенный в различных ротационных ориентациях на нуклеосомной ДНК. Методами компьютерного моделирования были рассчитаны оптимальные положения флуоресцентных меток на ДНК: для метки Cy3 в положении +67 п.н., и Cy5 в положении +150 п.н.на нуклеосомной ДНК. Были разработаны методики получения и последующей очистки ДНК-матриц с высоким общим выходом и сохранением флуоресцентных меток. Разработана методика сборки и оценки качества полученных нуклеосом, содержащих одиночные сайты связывания p53 в различных ротационных ориентациях на нуклеосомной ДНК. Полученные препараты нуклеосом были охарактеризованы методами электрофореза в нативном ПААГ и spFRET микроскопии в растворе. Получены чистые (>90%) препараты нуклеосом. Разработана методика изучения кинетики связывания p53 с полученными нуклеосомами R11 и R16, а также со свободной ДНК. Проделанная за отчетный период работа является надежной основой для проведения структурных и кинетических исследований, запланированных на следующие этапы проекта. Были амплифицированы три ДНК-матрицы длиной 167 п.н, содержащие фрагмент линкерной ДНК длиной 20 п.н. и нуклеосом-позиционирующую последовательность (НПП) s603 длиной 147 п.н с ковалентно пришитыми флуоресцентными метками Су3 и Су5, позволяющими анализировать изменения в структуре нуклеосом на основе анализа эффективности FRET между ними. Для последующих структурных исследований на основе этих ДНК-матриц и октамеров гистонов Xenopus laevis дикого типа были собраны три типа строго позиционированных нуклеосом, отличающихся положением меток Cy3/Cy5. Высокие эффективность и качество сборки мононуклеосом были проверены и подтверждены методом FRET-анализа в ПААГ-геле в условиях нативного электрофореза. Для дальнейших экспериментов по определению роли С-концевых доменов в разворачивании нуклеосомы дрожжевым комплексом FACT в клетках дрожжей были экспрессированы следующие варианты дрожжевого комплекса FACT: (1) димер Spt16/Pob3 с делецией С-конца белка Spt16 (Spt16dCT/Pob3), (2) Spt16/Pob3 с делецией С-конца белка Pob3 (Spt16/Pob3dCT), (3) Spt16/Pob3 с делецией двух С-концов (Spt16dCT/Pob3dCT), (4) Spt16/Pob3 дикого типа. Полученные гетеродимеры были очищены из клеток дрожжей. HMGB-белок Nhp6 был экспрессирован в клетках бактерий E.coli и очищен с использованием гель-фильтрации. За отчетный период были получены все компоненты (нуклеосомы, белки дикого и мутантного типа), необходимые для проведения дальнейших исследований механизма действия фактора FACT на структуру нуклеосом. Эти исследования запланированы на следующие этапы проекта. Определены оптимальные условия процедуры переноса комплексов на сетки для последующего изучения интермедиатов разворачивания нуклеосом фактором yFACT с использованием методов электронной микроскопии. По данным электронной микроскопии изучены проекционные структуры интермедиатов разворачивания нуклеосом фактором yFACT. Показано, что yFACT способен полностью разворачивать нуклеосомную ДНК с физическим разделением гистонов, а изолированный Nhp6 не влияет на структуру нуклеосомы. Для изучения влияния модификаций гистонов на реорганизацию нуклеосом фактором FACT были получены ДНК-матрицы 603 с флуоресцентными метками Су3 и Су5 в положениях 35 и 112 п.н. Получены рекомбинантные дрожжевые гистоны дикого типа, а также гистоны H2A.Z и H3K56Q. Собраны гистоновые октамеры следующих типов: октамеры, содержащие нативные гистоны H2A, H2B, H3 и Н4; октамеры, содержащие гистон H2A.Z; октамеры, содержащие H3K56Q; октамеры, содержащие H2A.Z и H3K56Q. Эти гистоновые октамеры были использованы для сборки серии флуоресцентно-меченых нуклеосом, отличающихся по составу гистонов. Проверено качество сборки нуклеосом и их пригодность для дальнейших структурных исследований, запланированных на последующие этапы проекта. Разработаны методики формирования всех видов одиночных субнуклеосом и полных нуклеосом и их транскрипции РНК полимеразой 2. Впервые показано, что дрожжевой фактор FACT значительно облегчает транскрипцию мононуклеосом РНК полимеразой 2 in vitro. Удаление каждого из С-концевых участков субъединиц фактора FACT приводит к существенному снижению эффективности действия фактора при транскрипции нуклеосом, но эффект удаления С-концевого участка Spt16 более выражен. Полученные данные подтверждают и позволяют уточнить модель FACT-зависимой транскрипции нуклеосом, предложенную нами ранее. Проведена подготовка к экспериментам по изучению изменений в структуре октамера гистонов в процессе разворачивания нуклеосом под действием белкового фактора FACT. Получен гистон H2A(S113C), который затем был помечен по остатку С113 меткой Су5. Получены ДНК-матрицы s603, меченые Су3 в положении 13 п.н. или 57 п.н. Собраны мононуклеосомы, содержащие Су5-меченый гистон H2A и ДНК с меткой Cy3 в одном из двух положений. Нуклеосомы были очищены от побочных продуктов сборки в нативном геле. Предсказаны ожидаемые изменения в эффективности FRET при различных сценариях изменения в структуре октамера гистонов при разворачивании нуклеосом под действием белкового фактора FACT. В культуре клеток насекомых SF9 был наработан и хроматографически очищен рекомбинантный димер Spt16/SSRP1. Методом электронной микроскопии макромолекул были исследованы структурные отличия между комплексами FACT дрожжей и человека в отсутствии нуклеосом, показано, что структура человеческого комплекса более компактная, чем дрожжевого комплекса. Таким образом, присутствие дополнительного HMGB-домена влияет на структуру комплекса, делая ее более компактной. Разработан метод коррекции квантовых выходов флуорофоров на нуклеосомах в условиях детекции одиночных молекул на основе данных о временах детекции фотонов флуоресценции донора и акцептора. Разработаны и созданы ДНК матрицы и нуклеосомы, меченные только меткой-донором, только меткой-акцептором и обеими метками. Разработан и апробирован протокол измерения квантовых выходов флуоресценции в режиме измерения одиночных молекул. Измерены изменения квантовых выходов флуоресценции меток Cy3 и Cy5 в составе нуклеосом по сравнению с выходами флуоресценции этих же меток в составе свободной ДНК. Было показано, что квантовый выход флуоресценции меток в составе нуклеосом возрастает для донора до 0,37, а акцептора - 0,7. Новые величины квантовых выходов были применены для расчета расстояний между флуоресцентными метками и дальнейшего построения молекулярных моделей. Для обработки данных измерений, а также упрощения процедуры проведения коррекции квантовых выходов в режиме одиночных молекул была разработана программа FretBurstsGUI с графическим интерфейсом. Данная программа позволяет одновременно анализировать данные нескольких экспериментов и интерактивно исследовать характеристики вспышек флуоресценции, в частности для произведения корректировки квантовых выходов. Получены расчетные компьютерные модели оптимального расположения флуорофоров Су3 и Су5 для выявления конформационных переходов в молекуле ДНК при связывании белков Nhp6 и p53. С использованием компьютерных моделей разработаны модельные субстратные двунитевые фрагменты ДНК для анализа связывания белков Nhp6 и р53 методами spFRET-микроскопии. Получены фрагменты ДНК длиной 18 п.н., позволяющие посадку лишь одной молекулы белка Nhp6, а также фрагменты ДНК длиной 41 п.н. (всего три фрагмента). Все фрагменты содержат флуоресцентные метки Су3 и Су5 в различных положениях комплементарных цепей, представляющие собой FRET-пару и позволяющие методами spFRET-микроскопии детектировать изменения в конформации ДНК при связывании белка. Степень очистки полученных фрагментов от однонитевых олигонуклеотидов и побочных продуктов ренатурации составила 90-95%. Получен препарат белка Nhp6. Разработан протокол эффективного образования комплексов между модельными фрагментами ДНК и белком Nhp6. Установлено, что при длине субстратной ДНК 18 п.н. концентрация белка в 0,5 мкМ достаточна для полного связывания ДНК (100 нМ), при длине 41 п.н. эффективное связывание наблюдается только при концентрации белка 1 мкМ. Определено, что при связывании белка Nhp6 с 18-п.н. фрагментом наблюдается повышение эффективности FRET от 0,35 до 0,55, при этом наблюдается формирование одного комплекса между ДНК и белком. Для более длинных фрагментов заметного повышения эффективного FRET не наблюдается, но наблюдается постепенное формирование двух комплексов при повышении концентрации Nhp6 (предположительно, стехиометрическое соотношение ДНК:Nhp6 1:1 и 1:2). Методом spFRET-микроскопии мононуклеосом в растворе установлено что в присутствии 50-250 мМ КCl линкерная ДНК может принимать одно из двух конформационных состояний: «открытое» (линкеры находятся на значительном расстоянии друг от друга), или «закрытое» (линкеры сближены друг с другом на протяжении не менее 25 п.н.). Замена ионов калия на натрий приводит к увеличению расстояния между линкерами в «закрытой» конформации и уменьшает заселенность этой конформации. При увеличении концентрации КCl до 300 мМ и выше происходит увеличение расстояния между линкерами в «закрытой» конформации и снижение заселенности этой конформации. Был разработан экспериментальный подход, позволяющий вводить флуоресцентную метку в область оси симметрии нуклеосомной частицы для ДНК-матриц, несущих длинные линкерные фрагменты. На основании широкого набора измеренных нами внутримолекулярных расстояний методами интегративного моделирования была построена модель, описывающая структурные особенности «закрытой» конформации линкерной ДНК. Была разработана и получена флуоресцентно-меченая ДНК-матрица для сборки динуклеосом, допускающая скольжение одной из формируемых на ней частиц. На этой ДНК-матрице были собраны динуклеосомы. Структурные особенности динуклеосом были охарактеризованы методами spFRET и криоэлектронной микроскопии. Подобраны условия для получения и получены in vitro одно- и двуслойные стабильные ко-кристаллы гистоноподобного белка Dps E.coli с ДНК. Кристаллы изучены в аналитическом электронном микроскопе, установлена кристаллическая структура и влияние на нее двухвалентных катионов. Показано, что Dps в составе ко-кристалла сохраняет свою ферритин-подобную активность, то есть может стимулировать окисление ионов Fe2+ до Fe3+. | ||
2 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний |
Результаты этапа: от, являются промежуточными в процессе конденсации хроматина. Впервые изучена морфология псевдо-ядра, образующегося в бактериях при заражении вирусами. Выдвинута гипотеза, что псевдо-ядро защищает ДНК бактериофага от повреждения репаративными системами бактерии. С помощью молекулярного моделирования были исследованы последствия введения однонитевого разрыва в ДНК. Установлено, что это приводит к снижению жесткости и повышению эластичности поврежденной, по сравнению с интактной, молекулы ДНК. Получены нуклеосомы, содержащие мутантные варианты гистонов H2A и Н2В, хвосты которых полностью (gH2A) или частично (H2BΔ1-31) делетированы. Установлено, что делеции в хвостах гистонов не влияют на структуру ДНК в коровой области нуклеосомы. Было определено, что участок 1-31 гистона Н2В (но не гистона Н2А) играет важную роль в стабилизации структуры нуклеосомного ядра, что позволило сделать вывод о том, что структурно схожие гистоны Н2А и Н2В отличаются по своей роли в поддержании стабильности нуклеосом. Были получены нуклеосомы с метками в линкерных фрагментах, содержащие димеры гистонов gH2A/H2BΔ1-31 и H2A/H2BΔ1-31. Установлено, что хвосты гистонов Н2А и Н2В существенно влияют на конформацию линкерной ДНК, удерживая линкерные фрагменты ДНК в сближенном состоянии. Показано, что хвосты гистонов Н2А и Н2В помогают линкерному гистону Н1 формировать стержень-подобную структуру линкерных фрагментов ДНК, и вследствие этого важны для правильной компактизации нуклеосом при образовании фибрилл. Методом spFRET микроскопии было показано, что присутствие второй нуклеосомы приводит к частичному отворачиванию от 10 до 30 п.н. ДНК от позиционированной нуклеосомы в составе динуклеосом. С помощью электронной микроскопии (ЭМ) с негативным контрастированием было показано, что расстояния между нуклеосомами в динуклеосоме изменяются скачком, с приращением 3-4 нм (примерно один оборот двойной спирали ДНК). Модели, полученные методами интегративного моделирования, позволяют предположить, что при вынужденном «столкновении» двух нуклеосом на ДНК может происходить ступенчатое с периодичностью ~10 п.н. (шаг равный одному обороту спирали ДНК) отворачивание от 10 до 30 п.н. нуклеосомной ДНК от гистонового октамера. Результаты моделирования в сочетании с данными, полученными методами ЭМ и spFRET позволяют заключить, что динуклеосомы – динамические, асимметрично разворачивающиеся комплексы, имеющие вариабельную структуру. Синтезирован флуоресцентно-меченный пептид LANA, известный своей способностью связываться с нуклеосомами, и реконструированы FAM-меченые нуклеосомы на основе октамера гистонов Xenopus laevis. Проведены эксперименты по подбору условий формирования комплекса Lana с нуклеосомами и разработке методических подходов к определению константы связывания природного пептида LANA с нуклеосомами по подвижности комплексов методом гель-электрофореза. | ||
3 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний |
Результаты этапа: Методами FRET в геле получены данные об изменении структуры нуклеосом R21 и R26 (сайты связывания белка p53 в положениях +21 и +26 п.н. от границы нуклеосомы) в комплексе с ДНК-связывающим доменом белка р53 (p53DBD). Охарактеризовано влияние ротационной ориентации сайта связывания белка p53DBD в составе нуклеосомы на эффективнось образования комплексов и их структуру. Методом футпринтинга с ДНКазой I были дополнительно охарактеризованы структуры нуклеосом R11 и R16 (центры сайтов связывания р53 в положениях +11 и +16 п.н.) в комплексе с p53DBD. Разработана методика получения флуоресцентно-меченых в области линкеров нуклеосом (NuR11-187 и NuR16-187) с различным расположением сайта связывания белка p53 на нуклеосомной ДНК. Оптимизирована методика получения комплексов белка p53DBD c этими нуклеосомами. Методами FRET в геле получены данные об изменении структуры нуклеосом в комплексе с p53DBD, установлена обратимость этих изменений. Получены данные о взаимодействии белка p53DBD с линкерной областью нуклеосом NuR11-187 и NuR16-187. Разработана методика, позволяющая анализировать взаимодействия белка p53DBD с нуклеосомами NuR11-187 и NuR16-187 в присутствии гистона H1. Получены новые данные о взаимодействии белка p53DBD и гистона H1. Исследована зависимость реорганизации нуклеосом шапероном гистонов FACT от присутствия в нуклеосомах химически-индуцированных ковалентных связей между гистонами. Было обнаружено, что дрожжевой FACT (yFACT) в присутствии фактора Nhp6 способен реорганизовывать нуклеосомы с искусственно усиленными гистон-гистоновыми взаимодействиями; охарактеризована эффективность этого процесса. Изучены двумерные структуры комплекса мутантного уFACTPob3dCT в различных конформациях. Обнаружено, что мутантный yFACT образует комплексы с нуклеосомой менее эффективно, чем интактный FACT. Определена роль домена Pob3-CTD в разворачивании нуклеосомы белковым фактором yFACT. Изучена зависимость эффективности реорганизации нуклеосом шапероном гистонов FACT от наличия в составе нуклеосомы вариантного гистона H2A.Z и ацетилированного гистона H3K56. Были получены три типа мононуклеосом с различным составом дрожжевых гистонов: помимо канонических гистонов в нуклеосомах присутствовали H2A.Z или миметик ацетилирования H3K56Q. Обнаружено, что введение таких гистонов в состав мононуклеосом существенно влияет на эффективность их реорганизации шапероном гистонов FACT. Обнаружены различия в диссоциации FACT из комплексов с разными типами нуклеосом. Cпособность кураксина CBL0137 дестабилизировать ДНК-гистоновые связи внутри нуклеосомы была исследована с использованием нуклеосом, содержащих флуоресцентную метку Су3 на ДНК-матрицах и флуоресцентную метку Су5 на гистоне Н2A с единичной аминокислотной заменой S113C. Анализ комплексов кураксин-нуклеосома методом spFRET микроскопии позволил заключить, что кураксин вызывает масштабное отворачивание нуклеосомной ДНК от октамера гистонов с сохранением структуры самого октамера и его взаимодействия с нуклеосомной ДНК. Изучены двухмерные структуры фактора FACT человека в апо-форме и его комплекса с нуклеосомой. Установлено расположение домена NTD-SPT16 в составе компактной формы hFACT. Предложена модель конформационной перестройки hFACT, происходящей при связывании этого белкового фактора с нуклеосомой, в основе которой лежит согласованное перемещение четырех доменов hFACT. Сделан вывод о том, что закрытый комплекс hFACT-нуклеосома удерживается консервативными взаимодействиями hFACT с ДНК и гистонами. Метод spFRET-микроскопии в геле апробирован для изучения локальных изменений в структуре ДНК при связывании белков. Сделан вывод, что в некоторых случаях (короткие фрагменты ДНК, наличие комплексов различной стехиометрии) такой подход оказывается наиболее информативным и предпочтительным. Этим методом была охарактеризована структура двух ДНК-белковых комплексов. Получены данные об отличиях конформации линкерного участка нуклеосомной ДНК, расположенного вблизи диадной оси нуклеосомы для нуклеосом, собранных с использованием гистонов G. gallus дикого типа и рекомбинантных гистонов X. laevis дикого типа. Установлено, что удаление N-концевого фрагмента гистона H2B X.laevis (Δ1-31) не оказывает влияния на конформацию линкерного участка нуклеосомной ДНК в области, отстоящей от границы нуклеосомы на 10 п.н. Вероятной причиной формирования конформации с большим расстоянием между линкерами для нуклеосом, собранных с применением мутантных димеров Н2А/H2BΔ1-31 и (глобулярный домен Н2А)/H2BΔ1-31, являются изменения в межлинкерном взаимодействии, вызываемые мутацией H2BΔ1-31. Синтезирован Су5-меченый природный пептид CENP-C 426–537 (далее CENP-C), взаимодействующий с нуклеосомами. Разработаны и оптимизированы методы определения константы связывания пептидов с нуклеосомами на основе метода гель-электрофореза с учетом неспецифических взаимодействий. Определены константы связывания пептидов CENP-C и LANA c нуклеосомами, установлено, что они находятся в субмикромолярном диапазоне. Пептид CENP-C по нашим данным обладает более высокой аффинностью к нуклеосомам, что может объясняться наличием дополнительных отрицательно заряженных аминокислот, взаимодействующих с гистоновым октамером вне кислотного лоскута. Была определена зависимость константы диссоциации комплексов пептид-нуклеосома от ионной силы раствора. Было показано, что связывание пептидов LANA и CENP-C влияет как на структуру нуклеосомы, так и на разворачивание нуклеосомы фактором FACT (в небольшой степени), а также приводит к стабилизации структуры нуклеосомы при ее восстановлении после диссоциации FACT. | ||
4 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний |
Результаты этапа: Получены новые данные о формировании тройного комплекса нуклеосома-p53DBD-H1.0, состоящего из нуклеосомы, ДНК-связывающего домена онкосупрессора р53 (p53DBD) и линкерного гистона Н1.0. С использованием нуклеосом, содержащих линкерную ДНК длиной по 20 п.н. с обеих сторон от нуклеосомы, показано, что при концентрации более 1 мкМ p53DBD формирует стабильный комплекс с нуклеосомой в присутствии линкерного гистона Н1.0 и неспецифичного регулятора связывания ядерных белков. Методом футпринтинга ДНК с использованием ДНКазы I определено, что при формировании комплексов нуклеосом с p53DBD происходят изменения в структуре прилежащих к сайту связывания белка участков ДНК – эти участки становятся более доступными для взаимодействия. Было также обнаружено, что предварительное формирование хроматосомы (комплекса нуклеосомы и линкерного гистона Н1.0) не препятствует этим структурным изменениям, но приводит к появлению дополнительных сайтов чувствительности ДНК к ДНКазе I внутри нуклеосомной ДНК. При этом сам участок связывания p53 оказывается менее чувствительным. Предположительно, связывание р53 может повышать доступность ДНК в хроматосомах для взаимодействия с другими белками-регуляторами. По результатам компьютерного анализа были отобраны три пептида с предполагаемой высокой аффинностью к кислотному лоскуту (аcidic patch) димера гистонов H2A-H2B и физико-химическими свойствами, удобными для синтеза и проведения экспериментов. Выбранные пептиды FKPGKGFTL (FL), FKPGKGYAN (FN), TKIHCHSIG (TG) были синтезированы методом твердофазного синтеза с флуоресцентной меткой флуоресцеином по N-концу пептида, а также без флуоресцентной метки. Исследования методом EMSA показали, что мечение данных пептидов флуоресцеином существенно влияет на их свойства, ограничивая возможность измерения их констант связывания с нуклеосомами методом электрофореза. Исследования методом spFRET микроскопии показали, что искусственный пептид FL не влияет на структуру нуклеосом и ингибирует нуклеосом-ремоделирующую активность белкового фактора FACT, а пептид TG дестабилизирует нуклеосомы, но не влияет на активность FACT. Искусственный пептид FN обладает сразу двумя свойствами природных пептидов LANA и CENP-C, взаимодействующих с кислотным лоскутом нуклеосом: он способен стабилизировать структуру нуклеосом и ингибирует нуклеосом-ремоделирующую активность белкового фактора FACT. При этом пептиды FL и FN, как ингибиторы про-опухолевого фактора FACT, выгодно отличаются от природных пептидов LANA и CENP-C: они короче, обладают меньшим общим положительным зарядом, что способствует снижению их неспецифических взаимодействий, являются патентнопригодными. Разработана экспериментальная система, позволяющая изучать структурные перестройки в тетрасомах по изменению расстояния между соседними супервитками ДНК в тетрасоме методом spFRET микроскопии. Установлено, что дрожжевой комплекс FACT в присутствии белка Nhp6 способен вызывать обратимые АТФ-независимые масштабные изменения в структуре тетрасом, не сопровождающиеся диссоциацией тетрамера гистонов от тетрасомной ДНК. Предложена модель структурных изменений в тетрасоме под действием yFACT (рисунок 1.2.2 Д), согласно которой: несколько молекул Nhp6 связываются с тетрасомной ДНК за счет электростатических взаимодействий и одновременно взаимодействуют с комплексом Spt16/Pob3 по С-концам субъединиц, вовлекая его в формирование супрамолекулярного комплекса с тетрасомой; Spt16/Pob3, взаимодействуя с тетрамером H3/H4, ослабляет его связи с тетрасомной ДНК, что приводит к распрямлению ДНК и образованию развернутой тетрасомы; тетрамер H3/H4 удерживается в составе супрамолекулярного комплекса за счет взаимодействий с Spt16/Pob3 и, возможно, с небольшим участком тетрасомной ДНК. Известно, что при прохождении транскрипции через нуклеосомы наблюдается интенсивный обмен гистоновых димеров H2A/H2B с образованием субнуклеосом – гексасом и тетрасом, которые могут вновь вовлекаться в транскрипцию. Обратимая реорганизация тетрасомной структуры комплексом FACT, предположительно, облегчает работу полимераз во время транскрипции и репликации, позволяя при этом сохранить структуру хроматина после завершения данных процессов. На основании полученных нами экспериментальных данных предложен механизм разворачивания нуклеосомы белковым комплексом yFACT (Sivkina et al. 2022): Nhp6 связывается с нуклеосомной ДНК, дестабилизируя взаимодействия ДНК с гистонами H2A и H2B вблизи границы нуклеосомы; Nhp6 взаимодействует с комплексом Spt16/Pob3 по С-концам субъединиц, изменяя его структуру и открывая сайты связывания с гистонами в медиальных доменах Spt16/Pob3; H2A/H2B связываются с C-концевыми фрагментами FACT, а молекулы Nhp6 занимают сайты связывания этих гистонов на нуклеосомной ДНК; Spt16/Pob3, взаимодействуя с тетрамером H3/H4, ослабляет его связи с нуклеосомной ДНК и способствует дальнейшему распрямлению ДНК с образованием развернутой нуклеосомы; тетрамер H3/H4 удерживается в составе развернутой нуклеосомы за счет взаимодействий с Spt16/Pob3 и небольшим участком нуклеосомной ДНК (рисунок 1.2.3). Установлено, что в процессе взаимодействия FACT с нуклеосомой образуется ряд комплексов, отличающихся по степени раскручивания нуклеосомной ДНК, а HMGB-белок, Nhp6, играет несколько различных ролей в процессе взаимодействия yFACT с нуклеосомой. Получены флуоресцентно-меченые мононуклеосомы, содержащие комбинацию рекомбинатных гистонов S. cerevisiae: вариантный гистон H2A.Z и мутантный гистон H3K56Q (H2A.Z/H3K56Q-содержащие нуклеосомы). С помощью spFRET-микроскопии установлено, что ремоделирование H2A.Z/H3K56Q-содержащих нуклеосом белковым комплексом yFACT проходит менее эффективно, чем H3K56Q-содержащих нуклеосом, однако более эффективно, чем H2A.Z-содержащих или канонических нуклеосом (рисунок 2.1.1, А-В). Выявлено, что H2A.Z и H3K56Q кооперативно затрудняют обращение ремоделирования нуклеосом комплексом yFACT (рисунок 2.1.1, Г). Около четверти H2A.Z/H3K56Q-содержащих нуклеосом не способны восстанавливать свою исходную структуру после диссоциации yFACT (рисунок 2.1.1, Г), что вызвано их разрушением с высвобождением нуклеосомной ДНК (рисунок 2.1.1, Д-Е). Получены данные об образовании комплексов HMGB-содержащих регуляторных белков HMO1 и HMGB1 с нуклеосомами и охарактеризованы изменения в структуре нуклеосомных частиц, вызываемые данными взаимодействиями. Установлено, что HMO1 способен образовывать комплексы с нуклеосомами вне зависимости от наличия или отсутствия линкерной ДНК. Он вызывает значительные изменения в укладке ДНК на октамере гистонов, а также способствует увеличению расстояния между линкерами в мононуклеосомах и хроматосомах (Malinina et al., 2022). Показано, что HMGB1 способен связываться только с линкерными нуклеосомами, и данное связывание не вносит конформационных изменений в коровую область нуклеосом, однако вызывает небольшое увеличение субпопуляции нуклеосом, характеризующейся уменьшенным расстоянием между спиралями линкерной ДНК. Выявлено, что в присутствии HMO1 и HMGB1 белковый комплекс FACT (дрожжевой и человеческий соответственно) связывается с нуклеосомами. HMO1 способствует обратимой АТФ-независимой реорганизации нуклеосом дрожжевым комплексом FACT, однако с меньшей эффективностью, в сравнении с Nhp6 (Malinina et al., 2022). HMGB1 в отличие от Nhp6 не поддерживает аналогичную активность фактора FACT человека, что может быть вызвано неспособностью HMGB1связываться с коровой областью нуклеосом. Было обнаружено, что при транскрипции в течении коротких промежутков времени эффективность задержки фермента увеличивается при наличии сшивок в составе нуклеосом. Полученные данные позволяют предположить, что при транскрипции нуклеосом, возможно, происходит разворачивание октамера гистонов, необходимое для эффективной транскрипции. Было определено, что наличие в составе нуклеосом гистонов, содержащих Н3К56Q или Н2АZ, существенно не влияет на судьбу нуклеосом при транскрипции. Полученные данные позволяют предположить, что более высокая эффективность транскрипции нуклеосом, содержащих Н3К56Q или Н2АZ, не приводит к увеличению эффективности вытеснения ДНК с поверхности октамера гистонов транскрибирующей РНК полимеразой 2. Было показано, что присутствие фактора FACT приводит к увеличению эффективности «выживания» как интактных, так и содержащих Н3К56Q или Н2АZ гексасом после транскрипции. Изучено строение FACT человека (hFACT) и комплексов FACT c нуклеосомой в присутствии кураксина с помощью электронной микроскопии и обработки изображений. Подтверждено разворачивание нуклеосом фактором hFACT в присутствии кураксина. Сравнение 2D и 3D реконструкций hFACT позволило показать, что открытие комплекса, скорее всего, происходит за счет согласованного движения четырех доменов FACT: SSRP1-NTD/DD-SPT16-DD, SSRP1-MD, SPT16-MD и Spt16-NTD. Впервые установлено положение домена Spt16-NTD в компактной конформации hFACT. Spt16-NTD является самым большим доменом, который при открывании комплекса гибко взаимодействует с остальными доменами и после этого не идентифицируется в реконструкции. Впервые предложен механизм разворачивания нуклеосомы фактором hFACT в присутствии кураксина: (1) ДНК-интеркалятор кураксин вызывает частичное отворачивание нуклеосомной ДНК от октамера гистонов, что обнажает hFACT-связывающие поверхности на димерах H2A-H2B; (2) hFACT связывается с дестабилизированной нуклеосомой и образует закрытый комплекс; (3) формируется развернутый комплекс, который стабилизируется благодаря множественным взаимодействиям различных доменов FACT с нуклеосомной ДНК и с гистонами. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".