ИСТИНА

Имеющиеся к настоящему времени данные указывают на то, что при развитии онкологических заболеваний имеет место тесная взаимосвязь опухоли и ее микроокружения, в частности, компонентов внеклеточного матрикса. Предположительно, клетки развивающейся опухоли имеют некоторые молекулярные особенности, которые позволяют им образовать вторичную опухоль в определенном органе или ткани [1-2]. С другой стороны, имеются предпосылки, позволяющие предположить, что опухолевые клетки обладают некоторой способностью к «адаптации». В зависимости от состава среды для культивирования опухолевые клетки проявляют повышенную способность к адгезии к тем компонентам внеклеточного матрикса, которые содержались в среде [3-5]. Кроме того, при культивировании в монослое клеток, полученных из фрагментов опухолей, меняется адгезионная способность таких клеток к белкам внеклеточного матрикса, а также соотношение интегриновых рецепторов, презентированных на клеточной поверхности [6-8]. Таким образом, в рамках исследования причин орган-специфичности метастазирования целесообразным выглядит установить, способна ли вышеупомянутая «адаптация» клеточной поверхности оказывать влияние на предпочтение метастазирующих опухолей к образованию вторичных очагов в конкретных органах. Иными словами, возможно ли, изменяя молекулярный состав клеточной поверхности путем модификации условий культивирования повлиять на орган-специфичность метастазирования. В качестве экспериментальной модели планируется использовать клетки метастатического рака кишечника, меланомы и молочной железы, имеющие различные органы-мишени для формирования вторичных опухолей. В качестве мишеней планируется использовать матриксы, полученные в результате децеллюляризации фрагментов внутренних органов, таких как легкое, печень и т.п. Способность к формированию вторичных очагов планируется оценивать по способности к адгезии к матриксам, полученным из децеллюляризованных органов. Список литературы 1. Paget S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Rev. 1989. V. 8. N 2. P. 98-101 2. Enns A, Gassmann P, Schlüter K, Korb T, Spiegel HU, Senninger N, Haier J. Integrins can directly mediate metastatic tumor cell adhesion within the liver sinusoids. J Gastrointest Surg. 2004. V. 8. N 8. P. 1049-1059; discussion 1060 3. Haraguchi M, Okubo T, Miyashita Y, Miyamoto Y, Hayashi M, Crotti TN, McHugh KP, Ozawa M. Snail regulates cell-matrix adhesion by regulation of the expression of integrins and basement membrane proteins. J Biol Chem. 2008. V. 283. N 35. P. 23514-23523 4. Gamal W, Borooah S, Smith S, Underwood I, Srsen V, Chandran S, Bagnaninchi PO, Dhillon B. Real-time quantitative monitoring of hiPSC-based model of macular degeneration on Electric Cell-substrate Impedance Sensing microelectrodes. Biosens Bioelectron. 2015. V. 71. P. 445-455 5. Moir LM, Black JL, Krymskaya VP. TSC2 modulates cell adhesion and migration via integrin-α1β1. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2012. V. 303. N 8. P. L703-10 6. Nip J, Shibata H, Loskutoff DJ, Cheresh DA, Brodt P. Human melanoma cells derived from lymphatic metastases use integrin alpha v beta 3 to adhere to lymph node vitronectin. J Clin Invest. 1992. V. 90. N 4. P.1406-1413. 7. Morrison BJ, Hastie ML, Grewal YS, et al. Proteomic Comparison of MCF-7 Tumoursphere and Monolayer Cultures. Lau ATY, ed. PLoS ONE. 2012. V. 7. N 12. P.e52692 8. Gilchrist CL1, Francisco AT, Plopper GE, Chen J, Setton LA. Nucleus pulposus cell-matrix interactions with laminins. Eur Cell Mater. 2011. V. 21. P. 523-32.

The purpose of the Project is the determination of the dependence of organ-specificity of the secondary tumor from the content of extracellular matrix, surrounding the forming metastase in the primary tumor. Literature data suggest that during cancer development there is a tight relationship between the tumor and its microenvironment, in particular, the components of extracellular matrix. Presumably, the cells of developing tumor have some molecular features, which give them possibility to form the secondary tumor in the particular organ or tissue [1-2]. By the other hand, there are prerequisites suggesting the ability of tumor cells to “adaptation”. Depending on the composition of the cultural medium cancer cells may demonstrate an increased ability in adherance to those components of the extracellular matrix, which contained in the cultural medium [3-5]. Moreover cultivation of the cells, derived from a tumor, as a monolayer culture changes their affinity to different ECM proteins and the ratio of integrin receptors on cell surface. [6-8]. So during the investigation of the causes of the organ-specifity of metastasis it seems reasonable to establish whether the above-mentioned "adaptation" of the cell surface can influence the preference of metastatic tumors to the formation of secondary foci in the specific organs. In other words, is it possible to change organ-specifity of metastases by the modification of the molecular composition of their surface arising from the variations in the cultivation conditions? We are planning to use the cells of the metastatic colon cancer, melanoma and breast cancer as experimental models. These cancers usually have different target organs during metastasis. We are planning to use the matrices of the decellularized organs (lung, liver and s on) as targets of metastasis. An ability to formation of the secondary tumors is going to be evaluated by an ability to adhere to the matrices derived from the decellularized organs. References 1. Paget S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Rev. 1989. V. 8. N 2. P. 98-101 2. Enns A, Gassmann P, Schlüter K, Korb T, Spiegel HU, Senninger N, Haier J. Integrins can directly mediate metastatic tumor cell adhesion within the liver sinusoids. J Gastrointest Surg. 2004. V. 8. N 8. P. 1049-1059; discussion 1060 3. Haraguchi M, Okubo T, Miyashita Y, Miyamoto Y, Hayashi M, Crotti TN, McHugh KP, Ozawa M. Snail regulates cell-matrix adhesion by regulation of the expression of integrins and basement membrane proteins. J Biol Chem. 2008. V. 283. N 35. P. 23514-23523 4. Gamal W, Borooah S, Smith S, Underwood I, Srsen V, Chandran S, Bagnaninchi PO, Dhillon B. Real-time quantitative monitoring of hiPSC-based model of macular degeneration on Electric Cell-substrate Impedance Sensing microelectrodes. Biosens Bioelectron. 2015. V. 71. P. 445-455 5. Moir LM, Black JL, Krymskaya VP. TSC2 modulates cell adhesion and migration via integrin-α1β1. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2012. V. 303. N 8. P. L703-10 6. Nip J, Shibata H, Loskutoff DJ, Cheresh DA, Brodt P. Human melanoma cells derived from lymphatic metastases use integrin alpha v beta 3 to adhere to lymph node vitronectin. J Clin Invest. 1992. V. 90. N 4. P.1406-1413. 7. Morrison BJ, Hastie ML, Grewal YS, et al. Proteomic Comparison of MCF-7 Tumoursphere and Monolayer Cultures. Lau ATY, ed. PLoS ONE. 2012. V. 7. N 12. P.e52692 8. Gilchrist CL1, Francisco AT, Plopper GE, Chen J, Setton LA. Nucleus pulposus cell-matrix interactions with laminins. Eur Cell Mater. 2011. V. 21. P. 523-32.

Планируется проведение большого пула подготовительных мероприятий, от которых зависит успешное выполнение проекта в последующие годы. Во-первых, это касается выбора клеточных линий и тщательной характеризации их как возможных моделей. В частности, одним из основных параметров является оценка способности клеток выбранных линий к формированию сфероидов. Результаты, полученные на данном этапе, будут представлены в виде протоколов условий культивирования конкретных клеточных линий, а также микрофотографий сфероидов и их характеристик (таких как размеры, плотность и т.п.). Кроме того, планируется осуществить дизайн олигонуклеотидов, позволяющих оценивать содержание различных цепей интегриновых рецепторов. Результаты будут представлены в виде данных ПЦР в реальном времени для клеток выбранных модельных линий, культивированных в различных условиях (в монослое, в сфероидах и т. п.). Кроме того, для интегриновых рецепторов, уровень которых изменяется в результате изменения условий культивирования, планируется провести анализ их содержания на поверхности клеток. Результаты будут представлены в виде данных, полученных с помощью клеточного сортера, а также в виде микрофотографий.

Был получен ряд стабильных клеточных линий, презентирующих на поверхности различные фрагменты экстрацеллюлярного домена MUC1 человека. Была сконструирована молекула, не подвергающаяся автопротеолизу и заякоренная в мембране клетки. Это позволило избавиться от возможных артефактов, связанных с диссоциацией экстрацеллюлярного домена MUC1. В ходе совместного русско-французского проекта РФФИ, завершившегося в 2017 году, была установлена взаимосвязь между презентацией на поверхности клеток различных фрагментов экстрацеллюлярного домена молекулы муцина MUC1 и изменением метастатического потенциала таких клеток. Оценку метастатического потенциала клеток проводили с использованием матригеля (инвазивность) и с использованием исскуственного эндотелия (интравазация). Было установлено, что область тандемных повторов, несущая гликозидные антигены sLea, играет ключевую роль в увеличении способности клеток к метастазированию. Было показано, что с увеличением количества тандемных повторов в молекуле MUC1 снижается количество мембранного MUC1 у клеток, растущих в прикрепленной культуре, при сохраняющемся высоком уровне экспрессии рекомбинантного белка. Была отработана методика роста клеток стабильных линий в трехмерных культурах. В ходе инициативного проекта РФФИ (2013-2015 гг) было показано, что кластеризация интегриновых рецепторов αVβ3 на поверхности клеток метастатической меланомы провоцирует открепление клеток от подложки и их гибель. Кластеризация интегринов αVβ3 возникает только при взаимодействии с агентом, содержащем несколько нелинейно располагающихс RGD-мотивов. Для исследования этого явления был создан тетрамеризующийся химерный рекомбинантный белок на основе стрептавидина, каждый мономер которого содержал RGD-мотив. При помощи анализа флуоресценции клеток, инкубированных с FITC-меченым SAV-RGD в течение определенных временных промежутков (шаг 15 мин), по скачку флуоресценции было установлено, что интернализация белка происходит через 30 мин после начала инкубации