| 1 |
16 апреля 2019 г.-31 декабря 2019 г. |
Структурные основы взаимодействия шаперонинов с амилоидогенными белками |
| Результаты этапа: Была отработана методика получения и очистки рекомбинантных белков GroEL, GroES и PrP, а также подобраны условия для получения комплексов GroEL - GroES и GroEL - PrP. Чистота препаратов подтверждена результатами гель-хроматографии и электрофореграммами проб. Формирование комплексов было показано с помощью методов динамического рассеяния света и электронной микроскопии негативного контрастирования на микроскопе JEOL 2100. Для получения структур GroEL и комплекса GroEL - PrP с высоким разрешением использовался криоэлектронный микроскоп Titan Krios, установленный в объекте инфраструктуры. Для замороженного образца GroEL было снято и обработано 590 стеков микрографий. С них были собраны изображения отдельных молекул и по ним строилась трёхмерная реконструкция GroEL с учётом симметрии D7 (всего для реконструкции использовалось 29700 частиц). Для образца GroEL - PrP было снято 1634 стека и отобрано 106260 частиц для построения трёхмерной реконструкции без симметрии. Разрешение структур составило 3.02 Å и 3.7 Å для GroEL и GroEL - PrP соответственно. Полученные структуры позволили установить, что мономер PrP связывается с I и H спиралями апикальных доменов двух соседних субъединиц GroEL. Также был проведен расчёт молекулярной динамики мономера PrP в воде. Для этого было построено 5 атомарных моделей, различающихся по стартовой конформации неструктурурованного N-концевого домена, и для каждой рассчитана траектория длиной 100 нс. Для всех систем было характерно сохранение укладки C-концевого домена и высокая конформационная подвижность N-концевого домена. Эти расчёты будут использованы для подготовки атомарной модели и проведения молекулярной динамики полноразмерного PrP и GroEL.
Часть результатов была представлена на 11-ой международной конференции «Structure and stability of biomacromolecules», прошедшей в Словакии с 3 по 6 сентября 2019 года. На конференции выступала и получила награду за лучший постер одна из основных исполнителей проекта Кудрявцева С.С. |
| 2 |
1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. |
Структурные основы взаимодействия шаперонинов с амилоидогенными белками |
| Результаты этапа: Была отработана методика выделения и очистки эукариотического шаперонина TRiC, подобраны условия для формирования комплекса TRiC ‒ PrP. Чистота препаратов подтверждалась с помощью метода электронной микроскопии негативного контрастирования. На установленном в объекте инфраструктуры криоэлектронном микроскопе Titan Krios было снято 1011 изображений для отдельного TRiC и 500 изображений для комплекса TRiC с PrP. Построенная трёхмерная реконструкция TRiC согласуется с ранее опубликованными. Сравнение классовых сумм отдельного TRiC и его комплекса с PrP выявило наличие дополнительной плотности в полости шаперонина. Также с помощью Titan Krios была получена структура комплекса бактериального шаперонина GroEL с кошапероном GroES с разрешением 3.62 Å, что выше разрешения ранее опубликованных структур GroEL ‒ GroES по данным крио-ЭМ. Эта структура не только указала на конформационную подвижность апикальных доменов, но и позволила выявить присутствие нуклеотидов в обоих кольцах. Это отличает её ото всех ранее опубликованных структур, как из крио-ЭМ, так и из рентгеноструктурного анализа. Сверх запланированной структуры было построено ещё две структуры комплекса GroEL ‒ GroES с разными конформациями нижнего кольца, ранее не описанными в литературе. Методом молекулярной динамики были исследованы внутримолекулярные взаимодействия в полноразмерном PrP и комплексе GroEL с достроенными С-концевыми последовательностями, которые не разрешаются структурными методами. Новый метод обработки экспериментальных данных с образца GroEL ‒ PrP позволил уточнить сайты связывания PrP. Результаты работы были доложены на российских и международных конференциях (в онлайн формате) и изложены в двух статьях.
|
| 3 |
1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. |
Структурные основы взаимодействия шаперонинов с амилоидогенными белками |
| Результаты этапа: Были оптимизированы условия подготовки образцов шаперонина TRiC для крио-ЭМ, для чего варьировались буферные условия, типы сеток, применялась дополнительная обработка сеток полилизином. Метод электронной микроскопии негативного контрастирования и съёмка изображений на просвечивающем электронном микроскопе Titan 80-300 использовались для оценки гомогенности образца и подбора концентрации. С помощью криоэлектронного микроскопа Titan Krios 60-300 было снято 2512 изображений замороженного образца, что позволило построить трёхмерную реконструкцию TRiC с разрешением 4.42 Å. Также с помощью Titan Krios 60-300 было снято 3359 изображений образца шаперонина GroEL в комплексе с амилоидогенным белком альфа-синуклеином, по которым была построена трёхмерная структура комплекса с разрешением 3.63 Å. Методом молекулярной динамики в программе GROMACS проведён расчёт траектории взаимодействия шаперонина GroEL с прионным белком. Результаты расчётов вместе с полученной в 2020 году крио-ЭМ структурой GroEL-PrP были опубликованы в журнале первого квартиля Biomedicines. Результаты работы 2020 года и полученная в 2020 году структура комплекса GroEL-GroES были опубликованы в журнале первого квартиля Scientific Reports и доложены на международных конференциях FEBS и Microscopy and Microanalysis. |
| 4 |
1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. |
Структурные основы взаимодействия шаперонинов с амилоидогенными белками |
| Результаты этапа: Были выделены и очищены белки для проведения исследований взаимодействия бактериального шаперонина GroEL с амилоидогенным белком альфа-синуклеином. Для оценки влияния GroEL на агрегацию альфа-синуклеина использовался флуоресцентный краситель тиофлавин Т, встраивающийся в амилоидные фибриллы в растворах, вследствие чего значительно возрастает квантовый выход его флуоресценции. Эти эксперименты показали, что GroEL способствует трансформации альфа-синуклеина и формированию амилоидных фибрилл при относительно высокой концентрации альфа-синуклеина. В том случае, когда концентрации GroEL и альфа-синуклеина равны, роста фибрилл не происходит, что может быть вызвано высокой аффинностью альфа-синуклеина к GroEL.
С целью подбора условий для получения эукариотического шаперонина TRiC в закрытой конформации проводилась съёмка негативно контрастированных и замороженных образцов белка. Витрификация препаратов производилась с использованием установки Leica EM GP2, для скрининга витрифицированных проб и сбора предварительных данных использовался просвечивающий электронный микроскоп JEOL JEM-2100, оборудованный криотрансферным держателем Gatan Elsa и детектором прямого обнаружения электронов Direct Electron DE-20. Варьировались следующие параметры: тип подложки, параметры гидрофилизации подложки, время блоттинга (удаления излишков препарата касанием фильтровальной бумагой) и концентрация АТФ. В результате было показано, что достаточной для перехода TRiC в закрытую конформацию является концентрация АТФ 0.4 мМ, наилучшее распределение отдельных частиц по поверхности сетки получается при использовании сеток с непрерывной углеродной подложкой, а дополнительная обработка сеток 0.1% раствором поли-L-лизина позволяет бороться с предпочтительной ориентацией частиц на сетке.
Набор данных для образца TRiC в закрытой конформации проводился с помощью криоэлектронного микроскопа Titan Krios 60-300, предварительная заморозка образцов осуществлялась с помощью установки для витрификации Vitrobot Mark IV (FEI). Было снято 1612 стеков изображений, их обработка и определение структуры проводились в программах Warp и CryoSPARC. Кроме того, была улучшена полученная в 2021 году структура TRiC в открытой конформации, её разрешение составило 4.16 Å.
Методом молекулярной динамики в программном пакете GROMACS были изучены структурно-динамические характеристики двух различных фрагментов амилоидных фибрилл PrP. В результате анализа внутримолекулярных взаимодействий (солевые мостики, водородные связи, гидрофобные контакты) были описаны ключевые для стабилизации фибрилл контакты.
Кроме того, сверх заявленного плана работ в рамках данного проекта методом крио-ЭМ была получена структура шаперонина бактериофага AR9 с разрешением 3.99 Å. Она представляет собой одно кольцо из семи идентичных субъединиц, и на её основе была построена полноатомная модель шаперонина AR9 в апо-форме. Было проведено её сравнение с бактериальным GroEL и фаговыми шаперонинами EL и OBP. Результаты этой части работы были опубликованы в журнале первого квартиля Biomedicines. |
