ИСТИНА

Важнейшим направлением, связанным с развитием медицинской биотехнологии, является поиск путей борьбы с устойчивостью патогенных штаммов микроорганизмов к лекарственным соединениям. В России разработана Стратегия предупреждения распространения антимикробной резистентности в РФ на период до 2030 г (распоряжение Правительства РФ от 25 сентября 2017 г. № 2045-р). В связи с вышесказанным принципиально важно учесть мировые тенденции в развитии медицинской биотехнологии в области молекулярных основ резистентности. Данный проект направлен на генетическое профилирование и метаболомный анализ микробных сообществ методами высокопроизводительного скрининга с целью решение проблемы поиска новых антибиотических препаратов, а также исследование механизмов и поиск лигандов, ингибирующих факторы резистентности микроорганизмов к существующим антибиотическим препаратам. Комбинированное использование таких препаратов может иметь решающее значение для решения проблемы лекарственной устойчивости к антибиотикам и явиться основой для нового направления в синтетической биологии. Общая идея реализации проекта заключается в ультравысокопроизводительном скрининге представителей микробиоты из природных источников с использованием разработанной нами технологии и оригинальных микрофлюидных чипов собственного производства (Terekhov, Smirnov et al. PNAS 2017; Terekhov, Smirnov et al. PNAS 2018). В ходе эксперимента проводится инкапсулирование пары микроорганизмов «мишень»-«эффектор» в капли двойной эмульсии. В качестве «мишени» используется флуоресцентный штамм микроорганизма, для которой поставлена задача поиска «эффектора» – штамма микроорганизма, способного продуцировать вещества (антимикробные пептиды, низкомолекулярные вещества) обладающие антимикробными свойствами, и как следствие, содержащего кластер(ы) генов их биосинтеза. Для регистрации антимикробной активности вводятся специальные флуоресцентные маркеры: (i) генно-инженерно вводится внутриклеточный флуоресцентный белок – для наблюдения за бактерией «мишенью», (ii) – флуоресцентный краситель Calcein violet (или аналог) – для идентификации живых клеток микроорганизмов и (iii) – флуоресцентный краситель для определения количества клеток бактерии «мишени» на начальном этапе скрининга. После инкубации при выбранных условиях проводится отбор «позитивных» инкапсулированных пар с использованием стандартного клеточного сортера (FACS AriaIII или аналог) и подобранных условиях сортинга. Полученные в результате отбора инкапсулированные пары анализируются методами NGS-секвенирования и масс-спектрометрии в режимах без и после культивации в стандартных условиях. Проводится биоинформатический анализ и определяются штаммы микроорганизмов, проводится поиск и идентификация кластеров генов биосинтеза веществ, осуществляющих антимикробное действие, а также при возможности сами антимикробные вещества. В ходе выполнения проекта будут решены задачи по исследованию природных источников бактериальных сообществ на наличие потенциальных продуцентов новых антимикробных соединений. Будет проведен скрининг и идентификация штаммов-продуцентов веществ, ингибирующих рост патогенных бактерий «мишеней», а также поиск кластеров генов и исследование механизмов биосинтеза веществ, обладающих антимикробной активностью. Научная новизна данного проекта базируется на использовании инновационных технологий ультравысокопроизводительного скрининга для поиска новых уникальных популяций бактерий-продуцентов антибиотиков. В отличие от классических источников бактериального разнообразия, таких как образцы почвенных бактерий, в рамках данного проекта мы планируем сконцентрировать свое основное внимание на таких малоизученных бактериальных сообществах как микробиота диких животных. Таким образом, использование современных методов поиска, идентификации и гетерологической экспрессии кластеров генов биосинтеза антибиотиков, а также веществ – ингибиторов факторов устойчивости является актуальной задачей современной медицинской биотехнологии РФ. Проект может явиться основой для одного из перспективных направлений современной синтетической биологии.

The most important direction associated with the development of medical biotechnology is the search for ways to combat the resistance of pathogenic strains of microorganisms to medicinal compounds. In Russia, a strategy has been developed to prevent the spread of antimicrobial resistance in the Russian Federation for the period up to 2030 (Order of the Government of the Russian Federation of September 25, 2017 No. 2045-p). In connection with the foregoing, it is of fundamental importance to take into account the global trends in the development of medical biotechnology in the field of the molecular basis of resistance. This project is aimed at genetic profiling and metabolic analysis of microbial communities using high-throughput screening methods to solve the problem of finding new antibiotic drugs, as well as studying the mechanisms and the search for ligands that inhibit microorganism resistance factors for existing antibiotic drugs. The combined use of such drugs can be crucial to solving the problem of drug resistance to antibiotics and form the basis for a new direction in synthetic biology. The general idea of the project is the ultrahigh-throughput screening of microbiota representatives from natural sources using the technology developed by us and original microfluidic chips of our own production (Terekhov, Smirnov et al. PNAS 2017; Terekhov, Smirnov et al. PNAS 2018). In the course of the experiment, a pair of microorganisms “target” - “effector” is encapsulated in a double emulsion droplet. The “target” is a fluorescent strain of a microorganism, which is tasked with finding an “effector” - a strain of a microorganism capable of producing substances (antimicrobial peptides, low molecular weight substances) with antimicrobial properties, and as a result, containing a cluster (s) of their biosynthetic genes. For the registration of antimicrobial activity, special fluorescent markers are introduced: (i) an intracellular fluorescent protein is introduced genetically engineering - to observe the bacterium “target”, (ii) - a fluorescent dye Calcein violet (or analog) - to identify living cells of microorganisms and (iii) - a fluorescent dye to determine the number of bacteria cells of the target at the initial stage of screening. After incubation under selected conditions, “positive” encapsulated pairs are selected using a standard cell sorter (FACS AriaIII or equivalent) and selected sorting conditions. The encapsulated pairs obtained as a result of the selection are analyzed by NGS sequencing and mass spectrometry in the modes without and after cultivation under standard conditions. A bioinformatics analysis is carried out and strains of microorganisms are determined, a search and identification of gene clusters of biosynthesis of substances performing an antimicrobial action, as well as the antimicrobial substances themselves are carried out. In the course of the project, the tasks of studying the natural sources of bacterial communities for the presence of potential producers of new antimicrobial compounds will be solved. Screening and identification of producer strains of substances that inhibit the growth of pathogenic bacteria “targets” will be performed, as well as the search for gene clusters and the study of the mechanisms of the biosynthesis of substances with antimicrobial activity. The scientific novelty of this project is based on the use of innovative ultrahigh-throughput screening technologies to search for new unique populations of antibiotic-producing bacteria. Unlike classical sources of bacterial diversity, such as samples of soil bacteria, within the framework of this project we plan to focus our attention on such poorly studied bacterial communities as the microbiota of wild animals. Thus, the use of modern methods of screening, identifying and heterologous expression of gene clusters of biosynthesis of antibiotics, as well as substances - inhibitors of resistance factors is an important task of modern medical biotechnology of the Russian Federation. The project can be the basis for one of the promising areas of modern synthetic biology.

В ходе реализации проекта будут проведены исследование природных источников бактериальных сообществ на наличие потенциальных продуцентов новых антимикробных соединений. Будет проведен систематический анализ кластеров биосинтеза антибиотиков, основанный на геномном майнинге и гетерологической продукции, что может позволить идентифицировать неизвестные ранее антибиотики в редких и/или «некультивируемых» микроорганизмах. Впервые будет проведен анализ состава микробиоты ротовой полости дикого кабана (Sus scrofa), амурского тигра (Panthera tigris altaica), также будет исследована микробиота представителей грызунов, в частности крыс (Rattus norvegicus), комодского варана (Varanus komodoensis), диких и домашних птиц, а также рыб Байкальского бассейна и других водных водоемов России. Использование неклассических источников биоразнообразия микроорганизмов становится трендом современных исследований, направленных на поиск антибиотических препаратов нового поколения (Chu et al., Nature Chemical Biology. 2016). Уникальность нашего подхода позволит нам с высокой эффективностью и скоростью провести анализ природных сообществ микроорганизмов с целью поиска кластеров биосинтеза новых антибиотических препаратов. С использованием полученных биообразцов будет проведен ультравысокопроизводительный скрининг и идентификация штаммов продуцентов веществ, ингибирующих рост патогенных бактерий, в том числе и резистентных. На основании полученных результатах скрининга будут идентифицированы веществ, обладающие антимикробной активностью, будет проведен поиск кластеров генов и исследование механизмов биосинтеза веществ, обладающих антимикробной активностью. Эксперименты по гетерологической экспрессии кластеров генов биосинтеза обнаруженных веществ позволят идентифицировать новые антибиотические препараты, которые могут стать прототипами новых лекарственных средств для борьбы с возбудителями инфекционных заболеваний в том числе и мультирезистентных. Кластеры генов биосинтеза антимикробных соединений, идентифицированные и изученные в ходе реализации данного проекта позволят направлено создавать и/или направленно модифицировать антимикробные препараты. Таким образом, полученные результаты могут стать основой для решения проблем синтетической биологии, связанных с поиском новых антибиотиков.

Научный коллектив имеет большой опыт работы в области молекулярной клеточной биологии; генной инженерии; микробиологии; наработке, выделению и очистке биологических объектов, а также их структурный и функциональный анализ. Членами авторского коллектива разработана и внедрена технология ультравысокопроизводительного поиска новых антибиотических препаратов, в том числе ингибиторов факторов резистентности к существующим антимикробным препаратам (Terekhov, Smirnov et al. PNAS 2017, Terekhov, Smirnov et al. PNAS 2018).