ИСТИНА

Проект направлен на решение проблемы, связанной с выяснением роли глутатионилирования в регуляции ответа клетки на окислительный стресс. Конкретной фундаментальной задачей данного проекта является исследование влияния глутатионилирования на каталитические параметры и стабильность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) и взаимосвязь этого процесса с окислительным стрессом. Протеомные исследования клеток млекопитающих выявили ряд белков, которые могут подвергаться глутатионилированию. Среди этих белков была обнаружена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД). Установлена взаимосвязь между повышением уровня активных форм кислорода и глутатионилированием ГАФД, однако физиологический смысл глутатионилирования ГАФД остается неясным. В ходе данного проекта предполагается разработать условия для получения глутатионилированной ГАФД, доказать образование смешанного дисульфида методом масс-спектрометрии (MALDI) и исследовать свойства глутатионилированной ГАФД (каталитические характеристики, стабильность и способность к восстановлению тиолами). Предварительные исследования планируется проводить на ферменте из мышц кролика. Одновременно планируется клонировать ГАФД человека в клетках E.coli, выделить рекомбинантный фермент из клеток продуцента и продолжить исследования с использованием рекомбинантной ГАФД человека. Данный проект позволит понять, является ли глутатионилирование ГАФД защитным механизмом, который предотвращает дальнейшее окисление белка и позволяет сохранить его и возможно затем восстановить модифицированные SH-группы, или же способствует разворачиванию белковой глобулы и её диссоциации на мономеры. Диссоциация ГАФД на мономеры представляет особый интерес в связи с участием денатурированных форм ГАФД в развитии апоптоза.

The project is aimed at solving problems related to the elucidation of the role of glutathionylation in the regulation of the cell response to oxidative stress. The specific fundamental objective of this project is to study the influence of glutathionylation on the catalytic parameters and stability of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPD) and the relationship of this process with oxidative stress. Proteome studies of mammalian cells have revealed a number of proteins that can be glutathionylated. Among these proteins was detected glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPD). The relationship between increased levels of reactive oxygen species and glutathionylation GAFD, however, the physiological meaning of glutathionylation GAFD remains unclear. In the course of this project is to develop the conditions for receiving glutathionylation GAFD, to prove the formation of mixed disulfide by the method of mass spectrometry (MALDI) and to explore the properties glutathionylation GAFD (catalytic properties, stability and ability to recover the thiols). A preliminary study will be scheduled for the enzyme from rabbit muscle. At the same time it is planned to clone GAFD person in E. coli cells, highlight the recombinant enzyme from the cells of a producer and to continue research using recombinant GAPD person. This project will allow to understand whether glutathionylation HAFD a protective mechanism that prevents further oxidation of the protein and allows to save it and may then restore the modified SH-groups, or contributes to the unfolding of the protein globule and its dissociation into monomers. GAFD dissociation into monomers is of particular interest in connection with the participation of denatured forms GAFD in the development of apoptosis.

При выполнении проекта планируется получение глутатионилированных производных ГАФД из разных источников и исследование характеристик модифицированного фермента в сравнении с интактными ферментами. Будет проведена идентификация глутатионилированных остатков в первичной структуре белков. Планируется исследовать влияние глутатионилирования на каталитические свойства, четвертичную структуру и стабильность ГАФД. Будут также изучены особенности глутатионилирование форм фермента, содержащих цистеиновые остатки с разной степенью окисления. На первый год выполнения проекта (2016 г.) запланировано проведение следующих экспериментов: 1. Получение глутатионилированной ГАФД из мышц кролика и исследование модифицированного белка методом MALDI масс-спектрометрии для доказательства включения глутатиона в активный центр ГАФД. 2. Исследование каталитических характеристик глутатионилированной ГАФД в сравнении с интактным ферментом. Исследование стабильности глутатионилированной ГАФД в сравнении с интактным ферментом, а также с ферментом, окисленным перекисью водорода в отсутствие глутатиона методом дифференциальной сканирующей калориметрии. 3. Получение клеток E.Coli, продуцирующих ГАФД человека и налаживание метода выделения рекомбинантного фермента. В дальнейшем планируется получение глутатионилированного производного ГАФД человека и исследование характеристик модифицированного фермента в сравнении с интактным ферментом. Распределение исполнителей по задачам проекта: M.Л. Куравский: клонирование ГАФД человека в клетках E.Coli; Е.В. Моисеева и К.В. Баринова: выделение ГАФД из мышц кролика, очистка рекомбинантной ГАФД человека из клеток продуцента; исследование характеристик глутатионилированных производных ГАФД. Н.В. Позднякова: техническая помощь в выполнении проекта (закупка реактивов, поддержание оборудования в рабочем состоянии). В 2016 г. будут получены следующие результаты: 1. Будет доказано включение глутатиона в активный центр ГАФД на основании исследования глутатионилированной ГАФД из мышц кролика методом MALDI масс-спектрометрии. 2. Будут определены каталитические характеристики глутатионилированной ГАФД в сравнении с интактным ферментом. 3. Будет изучена стабильность глутатионилированной ГАФД в сравнении с интактным ферментом, а также с ферментом, окисленным перекисью водорода в отсутствие глутатиона методом дифференциальной сканирующей калориметрии. 4. Будут получены клетки E.coli, продуцирующие ГАФД человека и налажен метод выделения рекомбинантного фермента.

В нашей лаборатории накоплен большой опыт исследования окисления SH-групп глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) из мышц кролика и отработаны методы определения числа окисленных SH-групп, природы продуктов окисления и обратимости этого процесса [1-3]. Выявлены условия, приближенные к физиологическим (низкие концентрации перекиси водорода), в которых происходит окисление части SH-групп ГАФД с образованием производных сульфеновой кислоты (S-OH). Такое мягкое окисление ГАФД представляет особый интерес, во-первых, потому что наблюдается в присутствии физиологических концентраций перекиси водорода (10-100 мкМ) и, следовательно, может происходить в организме, и во-вторых, приводит к появлению побочной активности фермента – ацилфосфатазной. Высказано предположение, что в определенных условиях наличие такой активности может приводить к разобщению окисления и фосфорилирования в гликолизе [4, 5]. Однако, добавление стехиометрических количеств восстановленного глутатиона к ГАФД, окисленной в мягких условиях, приводит к мгновенному исчезновению ацилфосфатазной активности без восстановления дегидрогеназной (неопубликованные данные). Эти данные позволяют предполагать, что в описанных условиях образуется смешанный дисульфид ГАФД с глутатионом (ГАФД-S-OH + G-SH > ГАФД-S-S-G), то есть глутатионилированная ГАФД. Таким образом, у нас есть возможности для получения глутатионилированной ГАФД из мышц кролика и для исследования особенностей модифицированной ГАФД по сравнению с интактным ферментом, а также с окисленным ферментом, не содержащим смешанных дисульфидов.

Показано, что глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из мышц кролика (ГАФД) практически полностью инактивируется в присутствии 200 мкМ перекиси водорода и 200 мкМ восстановленного глутатиона (GSH). Инкубация ГАФД, окисленной в присутствии GSH, с 5 мМ GSH или 5 мМ дитиотреитолом (ДТТ) приводит к восстановлению 15 или 70% ферментативной активности соответственно. Инкубация ГАФД в присутствии 200 мкМ перекиси водорода приводит к необратимой инактивации фермента. Методом MALDI-масс спектрометрического анализа в препарате ГАФД, окисленной в присутствии GSH, обнаружен остаток глутатиона, связанный с цистеином активного центра (Цис150) дисульфидной связью, а также внутримолекулярные дисульфидные мостики между Цис150 и Цис154. Анализ восстановления активности глутатионилированной ГАФД в присутствии избытка GSH и ДТТ позволил оценить содержание смешанного дисульфида и внутримолекулярных дисульфидных мостиков в молекуле белка. Показано, что тетрамер глутатионилированной ГАФД содержит 0,7 – 1,6 (в зависимости от соотношения Н2О2/GSH) остатков GSH, связанных дисульфидной связью с Цис150. При этом приблизительно в половине субъединиц тетрамера образуются внутримолекулярные дисульфидные мостики между Цис150 и Цис154. Оставшиеся активные центры могут содержать интактные SH-группы или необратимые продукты окисления SH-групп. Показано, что глутатионилирование ГАФД не оказывает существенного влияния на Км интактных субъединиц. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии исследованы параметры термоденатурации глутатионилированной ГАФД в сравнении с нативной и окисленной ГАФД. Показано, что окисление ГАФД перекисью водорода в отсутствие GSH приводит к небольшому снижению термостабильности, что следует из снижения значения параметра Tm (температура максимума кривой теплопоглощения) на 1,8 градуса и снижения калориметрической энтальпии в 1,2 раза. Глутатионилирование ГАФД приводит к снижению Tm на 6 градусов и энтальпии плавления в 2,2 раза. Эти данные говорят о существенном снижении термостабильности глутатионилированной ГАФД по сравнению с нативной ГАФД, а также по сравнению с окисленной ГАФД. Кроме того, расширение пика глутатионилированной ГАФД (снижение кооперативности разворачивания) говорит о частичном разворачивании белковой глобулы при глутатионилировании. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа человека экспрессирована в клетках E. coli. Из клеток-продуцентов выделен гомогенный препарат рекомбинантной ГАФД человека с удельной активностью 95 мкмоль NADH/мин мг.