![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Cистема репарации неканонических пар нуклеотидов («мисматчей») - MMR (от англ. mismatch repair system) существует в живых организмах от бактерий до человека. Необходимость данной системы для нормального функционирования организма определяет актуальность её исследования. Фундаментальной проблемой является выяснение механизма дискриминации цепей и инициации одноцепочечного разрыва в ДНК системой МMR в большинстве организмов. Цель проекта - всесторонняя характеристика свойств и функций белка MutL из Rhodobacter sphaeroides (rsMutL), обладающего эндонуклеазной активностью, и выяснение молекулярных механизмов взаимодействия MutL с белками–партнерами и ДНК в системе MMR. Бактерия R. sphaeroides представляет несомненный интерес в связи с изменчивостью в процессе метаболизма, способностью к фотосинтезу и выживаемости в различных условиях, а также перспективностью в плане практического применения. Одной из задач проекта является расширение и углубление знаний о роли ММR в механизмах адаптации бактерий, на примере R. sphaeroides, к изменяющимся факторам внешней среды. В ходе выполнения проекта планируется определить локализацию ДНК-связывающего центра rsMutL путем зондирования контактов в комплексе ДНК-rsMutL методом кросслинкинга; изучить кинетику связывания rsMutL с ДНК и конформационных изменений в rsMutL методом «остановленной струи». Ключевой задачей является детальный анализ катализа гидролиза ДНК белком rsMutL в присутствии ионов двухвалентных металлов, АТФ, в зависимости от концентрации белков MutS и бета-субъединицы ДНК-полимеразы III (бета-«зажима»). Полученные данные позволят понять, как контролируется эндонуклеазная активность rsMutL в клетке, и какие факторы позволяют избежать нежелательных разрывов в ДНК. В настоящее время нет единого мнения о том, остается ли в процессе инициации репарации белок MutS связанным с «мисматчем» или он в комплексе с другими белками движется по ДНК. Для ответа на этот вопрос мы предлагаем фиксировать rsMutS на ДНК и проверить, как он будет влиять на эндонуклеазную функцию rsMutL в отсутствие и в присутствии бета-«зажима». Интригующим моментом в функционировании бактериальных гомодимеров MutL (кроме гамма-протеобактерий) является их способность узнавать и гидролизовать дочернюю цепь ДНК. С помощью специально сконструированных ДНК-дуплексов будет проверена гипотеза о том, что маркером дочерней цепи могут быть одноцепочечные разрывы. Будут получены плазмиды, содержащие разное число тринуклеотидных повторов. Впервые будет детально исследован rsMutL-индуцируемый гидролиз повторяющихся генетически нестабильных последовательностей. Полученные результаты могут быть использованы для реконструкции основных этапов функционирования системы MMR в прокариотах, отличных от гамма-протеобактерий. Отдельные стадии механизма репарации в них, вполне вероятно, могут быть экстраполированы на эукариотические системы MMR.
Mismatch repair system (MMR) is required for normal functioning of any organism that determines the relevance of its investigation. The purpose of the project is the description of the properties and functions of MutL MMR protein from Rhodobacter sphaeroides (rsMutL), having endonuclease activity, and the elucidation of its interaction with molecular partners. A search of amino acid sequences homologous to rsMutL sequence in the database UniProt was done. Alignment of more than 400 sequences was performed. On the basis of the detected homology, rsMutL domains and binding sites with ligands were marked. We create three plasmid constructs carrying rsMutL gene. The reducing of the rate of synthesis of rsMutL in cell and increasing of its solubility were reached by using strain BL21(DE3)pLysS E. coli. The activity of the protein was tested for its ability to make a single-stranded break in a specially engineered plasmid containing a “mismatch” G/T. The enzyme most efficient hydrolyzed plasmid DNA in the presence of Mn2+ ions. Zn2+ ions practically did not stimulate endonuclease function of rsMutL, suggesting their importance for the stabilization of the protein structure. For the first time we attempted to study the impact of trinucleotide repeats in the implementation of the endonuclease function of bacterial MutL. G-rich strand of trinucleotide repeats (GGT/ACC)n can be folded into an intramolecular G-quadruplex. It was shown that the presence of 12 GGT/ACC does not effect on rsMutL functioning. In the case of MMR E. coli system, the function of the initial hydrolysis of defect DNA was performed by endonuclease MutH, which is analogous to rsMutL endonuclease domain. It was found that the presence of G-quadruplex in linear DNA also has no influence on the enzyme action. A structural and functional analog of rsMutL - nicking endonuclease BspD6I, was used to search for kinetics study conditions of interaction of proteins with endonuclease function with DNA duplexes by acoustic detection approach on the piezoelectric sensor. Linear DNA substrates with and without nick in one of the duplex strands were synthesized for investigation of specificity of rsMutL action. Duplexes with pyridylditio group were constructed for subsequent selective crosslinking of rsMutS and rsMutL variants. Growth curves of R. sphaeroides cell were analyzed under microaerobic, aerobic, anaerobic and phototrophic conditions differing aeration levels and presence/absence of light. The R. sphaeroides cell extracts that were obtaind under microaerobic conditions could be optimal for determination of to rsMutS and rsMutL activity.
В ходе реализации проекта будут получены следующие основные результаты. 1. Оптимизированы методики выделения rsMutL, rsMutS, rs-бета-«зажим», синтезированы фрагменты ДНК различной структуры для изучения функционирования этих белков. 2. Охарактеризован ДНК-связывающий центр rsMutL, получены кинетические параметры связывания и катализа гидролиза ДНК белком rsMutL, установлен минимальный кинетический механизм, описывающий конформационную динамику фермента в ходе этих процессов. 3. Выявлена роль ионов двухвалентных металлов, АТФ, rsMutS, rs-бета-«зажима» и искусственно введенных в ДНК одноцепочечных разрывов в функционировании rsMutL. Предложена модель взаимодействия белков rsMutL, rsMutS, rs-бета-«зажим» между собой и с ДНК. 4. Определено влияние наличия тринуклеотидных повторов в ДНК на ее гидролиз rsMutL. Эти результаты имеют большую ценность, так как изменение числа тринуклеотидных повторов вызывает нарушения в клеточном геноме. 5. На G/T-содержащем субстрате оценена эффективность функционирования rsMutL, rsMutS и системы MMR в целом в клеточных экстрактах, полученных из культур клеток R. sphaeroides, выращенных в различных условиях.
Впервые выделены белки MutL, MutS и бета-субъединица ДНК-полимеразы III (бета-«зажим») – компоненты системы репарации некомплементарных пар нуклеотидов из Rhodobacter sphaeroides, и продемонстрирована их активность. Показано, что rsMutL обладает эндонуклеазной функцией и наиболее эффективно гидролизует плазмидную ДНК в присутствии иона Mn2+. Продемонстрировано, что АТФ значительно ингибирует способность белка rsMutL расщеплять ДНК. На основании анализа данных для всех изученных MutL, обладающих эндонуклеазной функцией, показано, что наибольшее сходство, как по первичной структуре, так и по биохимическим свойствам, rsMutL проявляет с MutL из N. gonorrhoeae. Продемонстрирована применимость метода аффинной модификации белка реакционноспособными ДНК, основанного на реакции тиол-дисульфидного обмена, для зондирования аминокислотных остатков ecMutL, контактирующих с 59-звенным дуплексом с «мисматчем» G/T. Разработана методика выделения из реакционной смеси конъюгата ecMutS(N497C)-ДНК с помощью анионообменной ВЭЖХ. Методом FRET показано, что белок MutS в составе конъюгата способен «разгибать» ДНК при добавлении АТФ, т.е. сохраняет свою активность. Методом «остановленной струи» установлено, что скорость конформационной перестройки ДНК повышается с увеличением концентрации АТФ. Впервые охарактеризованы кинетические параметры основных стадий взаимодействия сенсорного белка MutS из Е. сoli с «мисматч»-содержащей ДНК и перехода димера белка в конформацию «скользящий зажим». Для этого разработана новая методология для кинетического анализа динамически подвижных белково-нуклеиновых комплексов на основе регистрации сигналов FRET во времени.
Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, позволят понять на примере бактерии Rhodobacter sphaeroides, как функционирует система репарации «мисматчей» в организмах, в которых отсутствуют гомологи белка MutH, как условия роста клеток этой бактерии влияют на эффективность работы системы MMR. Будет детально охарактеризована способность rsMutL вносить разрыв в ДНК, выявлены факторы белковой и небелковой природы, регулирующие этот процесс. Такие исследования представляют особую важность, т.к. системы MMR в подобных бактериях наиболее схожи с эукариотическими системами.
ИХБФМ СО РАН | Соисполнитель |
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 10 февраля 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Инициация репарации "мисматчей" белком MutL из альфа-протеобактерии Rhodobacter sphaeroides: факторы, определяющие гидролиз и дискриминацию цепей ДНК |
Результаты этапа: На примере бактерии Rhodobacter sphaeroides определены подходы к пониманию механизмов функционирования системы репарации «мисматчей» в организмах, в которых отсутствуют гомологи белка MutH. Детально охарактеризована способность rsMutL вносить разрыв в ДНК, выявлены факторы белковой и небелковой природы, регулирующие этот процесс. Такие исследования представляют особую важность, т.к. системы MMR в подобных бактериях наиболее схожи с эукариотическими системами. - Выделены рекомбинантные белки rsMutL, rsMutS и rs-бета-«зажим», проверена их активность. - Синтезированы линейные протяжённые ДНК-субстраты, содержащие и не содержащие разрыв в одной из цепей, 200-звенные дуплексы с пиридилдисульфидной группировкой для последующего селективного кросслинкинга мутантных форм белков rsMutS и rsMutL, получена 80-звенная ДНК, содержащая флуорофор TAMRA, сконструированы плазмидные ДНК для исследования функционирования rsMutL в различных условиях, а также плазмиды с разным числом тринуклеотидных повторов. | ||
2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Инициация репарации "мисматчей" белком MutL из альфа-протеобактерии Rhodobacter sphaeroides: факторы, определяющие гидролиз и дискриминацию цепей ДНК |
Результаты этапа: Проведена оценка влияния тринуклеотидных повторов и квадруплексов в ДНК на ее гидролиз rsMutL. Осуществлены подходы к выяснению вопроса, способен ли белок ecMutS после связывания с неканонической формой ДНК активировать пути ее процессинга, в частности, привлекать координирующий белок ecMutL и эндонуклеазу MutH, гидролизующую ДНК. Исследовано влияние одноцепочечных разрывов в ДНК на специфичность гидролиза субстрата эндонуклеазой rsMutL. Проведено комплексное исследование по локализация ДНК-связывающего центра белков ecMutL и rsMutL. Разработана методика получения экстракта клеток R. sphaeroides, позволяющая определять в нем активность белков MutS и MutL. | ||
3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Инициация репарации "мисматчей" белком MutL из альфа-протеобактерии Rhodobacter sphaeroides: факторы, определяющие гидролиз и дискриминацию цепей ДНК |
Результаты этапа: Cистема репарации неканонических пар нуклеотидов или «мисматчей» (MMR) необходима для нормальной жизнедеятельности любого организма, что определяет актуальность её исследования. Цель данного проекта - характеристика свойств и функций белка MutL из системы MMR Rhodobacter sphaeroides (rsMutL), обладающего эндонуклеазной активностью, и выяснение его взаимодействия с молекулярными партнерами. Методами биоинформатического анализа охарактеризована первичная, вторичная и третичная структуры rsMutL. В С-концевом домене rsMutL идентифицированы 5 мотивов, формирующих каталитический центр белка, ответственный за гидролиз ДНК. В N-концевом домене выявлены 7 консервативных мотивов, образующих участок связывания ATP и характерных для ATPаз семейства GHKL. Белок rsMutL с эволюционной точки зрения наиболее близок к гомологам из бактерии N. gonorrhoeae и из бактерии P. aeruginosa. Вместе с тем, он в 10 раз быстрее гидролизует АТФ по сравнению с родственными белками, что, возможно, обуславливает большую конформационную подвижность rsMutL. Методом «остановленной струи» показано, что связывание rsMutL с флуоресцентно меченной ДНК происходит в течение первых нескольких секунд взаимодействия. Учитывая низкую стабильность rsMutL, для подбора условий анализа кинетики его взаимодействия с ДНК использовали бифункционый фермент – С5-цитозиновую ДНК-метилтрансферазу SsoII, а также структурный и функциональный аналог rsMutL - никующую эндонуклеазу BspD6I. Методом сайт-направленного мутагенеза получены варианты ДНК-связывающего N-концевого домена rsMutL, содержащие единственный остаток Cys в заданной позиции. Образование ДНК-белковых конъюгатов в ходе селективного «кросслинкинга» между остатками Cys и ДНК-дуплексом, содержащим пиридилдисульфидную группу, продемонстрировало сближенность лиганда с аминокислотными остатками в положениях 233, 263 и 295 в процессе формирования ДНК-белкового комплекса. Получены важные результаты о влиянии АТФ и ионов Zn2+, Mg2+ и Mn2+ на эндонуклеазную функцию rsMutL, полезные с точки зрения регуляции действия системы MMR. На примере белков из R. sphaeroides и E. coli установлено, что фиксация MutS на ДНК в «мисматч»-связывающем районе белка не препятствует формированию тройного комплекса MutS-ДНК-MutL. Впервые показано, что белки MutS и MutL из обеих бактерий способны образовывать прочный комплекс с внутримолекулярным параллельным G-квадруплексом в составе двутяжевой ДНК, однако инициации репарации в отличие от «мисматч»-содержащего дуплекса в этом случае не происходит. Продемонстрирован «мультитаргетный» эффект G-квадруплексов и их высокая специфичность в отношении злокачественных клеток. Методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией оценена эффективность транскрипции генов белков MutS и MutL из R. sphaeroides в клетках, выращенных в микроаэробных условиях, как в отсутствие, так и при воздействии различных вызывающих стресс условий внешней среды или реагентов. В стандартных условиях транскрипция гена rsmutS более эффективна, чем гена rsmutL. При воздействии на клетки УФ-света уровень транскрипции обоих генов снижается примерно в 4 раза, в то время как при добавлении в клеточную культуру трет-бутилгидропероксида эффективность их транскрипции повышается. Сконструирована плазмида, позволяющая анализировать эффективность функционирования MMR в клеточных экстрактах. Полученные результаты, несомненно, представляют интерес в связи с изменчивостью R. sphaeroides в процессе метаболизма и жизненного цикла, способностью к фотосинтезу, выживаемостью в различных условиях и применением в биотехнологии. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".
№ | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
---|---|---|---|---|---|
1. | Отчет по НИР за 2016 год | Kubareva_otchet2016.pdf | 2,1 МБ | 24 декабря 2016 [KubarevaEA] |