ИСТИНА

Cистема репарации неканонических пар нуклеотидов («мисматчей») - MMR (от англ. mismatch repair system) существует в живых организмах от бактерий до человека. Необходимость данной системы для нормального функционирования организма определяет актуальность её исследования. Фундаментальной проблемой является выяснение механизма дискриминации цепей и инициации одноцепочечного разрыва в ДНК системой МMR в большинстве организмов. Цель проекта - всесторонняя характеристика свойств и функций белка MutL из Rhodobacter sphaeroides (rsMutL), обладающего эндонуклеазной активностью, и выяснение молекулярных механизмов взаимодействия MutL с белками–партнерами и ДНК в системе MMR. Бактерия R. sphaeroides представляет несомненный интерес в связи с изменчивостью в процессе метаболизма, способностью к фотосинтезу и выживаемости в различных условиях, а также перспективностью в плане практического применения. Одной из задач проекта является расширение и углубление знаний о роли ММR в механизмах адаптации бактерий, на примере R. sphaeroides, к изменяющимся факторам внешней среды. В ходе выполнения проекта планируется определить локализацию ДНК-связывающего центра rsMutL путем зондирования контактов в комплексе ДНК-rsMutL методом кросслинкинга; изучить кинетику связывания rsMutL с ДНК и конформационных изменений в rsMutL методом «остановленной струи». Ключевой задачей является детальный анализ катализа гидролиза ДНК белком rsMutL в присутствии ионов двухвалентных металлов, АТФ, в зависимости от концентрации белков MutS и бета-субъединицы ДНК-полимеразы III (бета-«зажима»). Полученные данные позволят понять, как контролируется эндонуклеазная активность rsMutL в клетке, и какие факторы позволяют избежать нежелательных разрывов в ДНК. В настоящее время нет единого мнения о том, остается ли в процессе инициации репарации белок MutS связанным с «мисматчем» или он в комплексе с другими белками движется по ДНК. Для ответа на этот вопрос мы предлагаем фиксировать rsMutS на ДНК и проверить, как он будет влиять на эндонуклеазную функцию rsMutL в отсутствие и в присутствии бета-«зажима». Интригующим моментом в функционировании бактериальных гомодимеров MutL (кроме гамма-протеобактерий) является их способность узнавать и гидролизовать дочернюю цепь ДНК. С помощью специально сконструированных ДНК-дуплексов будет проверена гипотеза о том, что маркером дочерней цепи могут быть одноцепочечные разрывы. Будут получены плазмиды, содержащие разное число тринуклеотидных повторов. Впервые будет детально исследован rsMutL-индуцируемый гидролиз повторяющихся генетически нестабильных последовательностей. Полученные результаты могут быть использованы для реконструкции основных этапов функционирования системы MMR в прокариотах, отличных от гамма-протеобактерий. Отдельные стадии механизма репарации в них, вполне вероятно, могут быть экстраполированы на эукариотические системы MMR.

Mismatch repair system (MMR) is required for normal functioning of any organism that determines the relevance of its investigation. The purpose of the project is the description of the properties and functions of MutL MMR protein from Rhodobacter sphaeroides (rsMutL), having endonuclease activity, and the elucidation of its interaction with molecular partners. A search of amino acid sequences homologous to rsMutL sequence in the database UniProt was done. Alignment of more than 400 sequences was performed. On the basis of the detected homology, rsMutL domains and binding sites with ligands were marked. We create three plasmid constructs carrying rsMutL gene. The reducing of the rate of synthesis of rsMutL in cell and increasing of its solubility were reached by using strain BL21(DE3)pLysS E. coli. The activity of the protein was tested for its ability to make a single-stranded break in a specially engineered plasmid containing a “mismatch” G/T. The enzyme most efficient hydrolyzed plasmid DNA in the presence of Mn2+ ions. Zn2+ ions practically did not stimulate endonuclease function of rsMutL, suggesting their importance for the stabilization of the protein structure. For the first time we attempted to study the impact of trinucleotide repeats in the implementation of the endonuclease function of bacterial MutL. G-rich strand of trinucleotide repeats (GGT/ACC)n can be folded into an intramolecular G-quadruplex. It was shown that the presence of 12 GGT/ACC does not effect on rsMutL functioning. In the case of MMR E. coli system, the function of the initial hydrolysis of defect DNA was performed by endonuclease MutH, which is analogous to rsMutL endonuclease domain. It was found that the presence of G-quadruplex in linear DNA also has no influence on the enzyme action. A structural and functional analog of rsMutL - nicking endonuclease BspD6I, was used to search for kinetics study conditions of interaction of proteins with endonuclease function with DNA duplexes by acoustic detection approach on the piezoelectric sensor. Linear DNA substrates with and without nick in one of the duplex strands were synthesized for investigation of specificity of rsMutL action. Duplexes with pyridylditio group were constructed for subsequent selective crosslinking of rsMutS and rsMutL variants. Growth curves of R. sphaeroides cell were analyzed under microaerobic, aerobic, anaerobic and phototrophic conditions differing aeration levels and presence/absence of light. The R. sphaeroides cell extracts that were obtaind under microaerobic conditions could be optimal for determination of to rsMutS and rsMutL activity.

В ходе реализации проекта будут получены следующие основные результаты. 1. Оптимизированы методики выделения rsMutL, rsMutS, rs-бета-«зажим», синтезированы фрагменты ДНК различной структуры для изучения функционирования этих белков. 2. Охарактеризован ДНК-связывающий центр rsMutL, получены кинетические параметры связывания и катализа гидролиза ДНК белком rsMutL, установлен минимальный кинетический механизм, описывающий конформационную динамику фермента в ходе этих процессов. 3. Выявлена роль ионов двухвалентных металлов, АТФ, rsMutS, rs-бета-«зажима» и искусственно введенных в ДНК одноцепочечных разрывов в функционировании rsMutL. Предложена модель взаимодействия белков rsMutL, rsMutS, rs-бета-«зажим» между собой и с ДНК. 4. Определено влияние наличия тринуклеотидных повторов в ДНК на ее гидролиз rsMutL. Эти результаты имеют большую ценность, так как изменение числа тринуклеотидных повторов вызывает нарушения в клеточном геноме. 5. На G/T-содержащем субстрате оценена эффективность функционирования rsMutL, rsMutS и системы MMR в целом в клеточных экстрактах, полученных из культур клеток R. sphaeroides, выращенных в различных условиях.

Впервые выделены белки MutL, MutS и бета-субъединица ДНК-полимеразы III (бета-«зажим») – компоненты системы репарации некомплементарных пар нуклеотидов из Rhodobacter sphaeroides, и продемонстрирована их активность. Показано, что rsMutL обладает эндонуклеазной функцией и наиболее эффективно гидролизует плазмидную ДНК в присутствии иона Mn2+. Продемонстрировано, что АТФ значительно ингибирует способность белка rsMutL расщеплять ДНК. На основании анализа данных для всех изученных MutL, обладающих эндонуклеазной функцией, показано, что наибольшее сходство, как по первичной структуре, так и по биохимическим свойствам, rsMutL проявляет с MutL из N. gonorrhoeae. Продемонстрирована применимость метода аффинной модификации белка реакционноспособными ДНК, основанного на реакции тиол-дисульфидного обмена, для зондирования аминокислотных остатков ecMutL, контактирующих с 59-звенным дуплексом с «мисматчем» G/T. Разработана методика выделения из реакционной смеси конъюгата ecMutS(N497C)-ДНК с помощью анионообменной ВЭЖХ. Методом FRET показано, что белок MutS в составе конъюгата способен «разгибать» ДНК при добавлении АТФ, т.е. сохраняет свою активность. Методом «остановленной струи» установлено, что скорость конформационной перестройки ДНК повышается с увеличением концентрации АТФ. Впервые охарактеризованы кинетические параметры основных стадий взаимодействия сенсорного белка MutS из Е. сoli с «мисматч»-содержащей ДНК и перехода димера белка в конформацию «скользящий зажим». Для этого разработана новая методология для кинетического анализа динамически подвижных белково-нуклеиновых комплексов на основе регистрации сигналов FRET во времени.

Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, позволят понять на примере бактерии Rhodobacter sphaeroides, как функционирует система репарации «мисматчей» в организмах, в которых отсутствуют гомологи белка MutH, как условия роста клеток этой бактерии влияют на эффективность работы системы MMR. Будет детально охарактеризована способность rsMutL вносить разрыв в ДНК, выявлены факторы белковой и небелковой природы, регулирующие этот процесс. Такие исследования представляют особую важность, т.к. системы MMR в подобных бактериях наиболее схожи с эукариотическими системами.