ИСТИНА

МикроРНК являются малыми молекулами, которые специфически ингибируют экспрессию генов путем так называемой РНК-интерференции или «сайленсинга». Исследования генома человека показали, что существует порядка 2000 микроРНК, часть из которых является тканеспецифическими. Установлено, что микроРНК выполняют регуляторную роль в целом ряде биологических процессов, например они важны для эмбрионального развития (Bartel, 2009). Показано также, что микроРНК играют важную роль в физиологии и патофизиологии сердечнососудистой системы; выявлена их связь с формированием ряда патологий сердца и сосудов. МикроРНК рассматриваются также как маркеры сердечнососудистых заболеваний (Condorelli et al., 2014; van Rooij et al., 2008a; Wang et al., 2014b). Хорошо известно, что так называемые транскрипционные факторы являются внутриклеточными молекулами регулирующими экспрессию генов. Транскрипционные факторы (ТФ) контролируют так называемый «электрофизиологический фенотип» клеток сердца – кардиомиоцитов: под управлением ТФ в кардиомиоцитах экспрессируются гены определенных ионных каналов и переносчиков, в результате чего клетки сердца приобретают биоэлектрическую активность, свойственную рабочему миокарду, либо миокарду пейсмекера (ритмоводителя). В настоящее время показано, что ТФ и микроРНК тесно взаимодействуют. Возможно, что экспрессия генов ТФ и ионных каналов/переносчиков находятся под контролем микроРНК (Bucchi et al., 2006; Hu et al., 2014; Marban and Cingolani, 2015; Potapova et al., 2004). Благодаря нескольким пионерским работам, в том числе группы под руководством Г.Добржинской (D'Souza et al., 2017) показано, что существуют микроРНК, специфически экспрессируемые в различных отделах сердца, в том числе в пейсмекерном миокарде синоатриального узла, а также то, что эти специфические микроРНК влияют на его автоматическую активность. Более того, на основе аналитических биоинформационных исследований сделано предположение о том, какие именно микроРНК могут обладать регуляторной активностью в пейсмекерном и рабочем миокарде. Эти предположения требуют экспериментального подтверждения: практически полностью отсутствуют сведения о влиянии in vivo и конкретных механизмах действия микроРНК на пейсмекерный и рабочий миокард сердца, сведения об их участии в симпатическом и парасимпатическом контроле работы миокарда. В данном проекте планируется достичь две цели, одна из которых носит фундаментальный характер, а вторая в большей степени является прикладной. Первая цель заключается в исследовании роли микроРНК в формировании структуры и преобразовании электрофизиологических свойств ритмоводителя сердца в ходе постнатального онтогенеза, а также в поиске конкретных ионных механизмов, посредством которых микроРНК оказывают действие на электрофизиологические свойства миокарда. Вторая цель состоит в выяснении возможности воздействия на пейсмекерную активность синоатриального узла при системном введении микроРНК взрослым животным, а также их воздействия на аритмогенные свойства миокардиальной ткани легочных вен. Возможность достижения целей проекта рассматривается авторами как высокая, поскольку существует определенный перечень микроРНК, которые как ожидается будут обладать эффективностью в пейсмекерном и рабочем миокарде. Всего в работе будет использовано шесть таких микроРНК кандидатов. Известно, что три из отобранных микроРНК могут взаимодействовать с продуктами генов, определяющих пейсмекерный характер биоэлектрической активности кардиомиоцитов, а другие три микроРНК – с продуктами генов, обуславливающих характер биоэлектрической активности, свойственной рабочим кардиомиоцитам. Предполагается, что первая группа микроРНК может обладать способностью подавлять эктопическую активность в аритмогенном миокарде. Таким образом, реализация проекта позволит определить возможность практического применения новых эндогенных регуляторов работы сердца при коррекции работы пейсмекерного миокарда, а также коррекции биоэлектрической активности, способствующей возникновению нарушений ритма сердца. Данное исследование будет проведено с использованием нескольких видов лабораторных животных, что позволит максимально подробно изучить разные аспекты ионных механизмов действия микроРНК. В работе будет применен целый ряд методов исследования, как экспериментальных электрофизиологических, так и аналитических. Для решения поставленных в проекте задач будут проведены in vivo эксперименты на интактных животных, ex vivo эксперименты с тканевыми препаратами миокарда и изолированными клетками - кардиомиоцитами. Ранее подобных комплексных исследований не проводилось.

MicroRNAs (miRNAs) are the small molecules which selectively inhibit the expression of genes by means of so-called RNA-interference or “silencing”. About 2,000 miRNAs have been discovered in the human genome, and many of them are tissue-specific. A number of cardiac specific miRs have been shown to regulate several biological processes, including the embryonic development (Bartel, 2009). Extensive amounts of data accumulated in recent years demonstrate their important role in the physiology and pathophysiology of cardiovascular system, as well as their potential application as biomarkers of some cardiovascular diseases (Condorelli et al., 2014; van Rooij et al., 2008a; Wang et al., 2014b). It is well known that such intracellular molecules as transcription factors (TF) regulate the genes expression. TF control the so-called “electrophysiological phenotype” of the cardiac cells. They govern the expression of particular ionic channels and transporters and that results in definite pattern of bioelectrical activity in these cells. This patter may more or less represent the “working myocardium” or pacemaker electrical activity. The tight interactions between TF and microRNAs have been shown. It is likely that expression of TF genes and ionic channels/transporters are controlled by microRNAs (Bucchi et al., 2006; Hu et al., 2014; Marban and Cingolani, 2015; Potapova et al., 2004). It has been demonstrated in several pioneering studies by group of H.Dobrzynski (D'Souza et al., 2017) that several types of miRNAs are specifically expressed in different parts of the heart, including the pacemaking myocardium of the sinoatrial node, and moreover can modulate its automaticity. Basing on the analytical bioinformation investigations, several particular types of miRNAs were supposed as regulators for pacemaking and working atrial myocardium. However, these suggestions need to the experimental approvement, since there is no available information about in vivo effects and distinct mechanisms of miRNA influence on pacemaking and working myocardium, either about their participation in sympathetic and parasympathetic control of cardiac function. The present project aims to reach two main goals, one of which is basic, while the second is more applied. The first goal is to understand the role of miRNAs in development of cardiac pacemaker structure and electrophysiological properties during the postnatal ontogenesis, and to discover the distinct ionic mechanisms responsible for miRNA cardiotropic influence. The second goal is to check the possibility of modulating the sinoatrial node pacemaking activity and arrhythmogenic activity of pulmonary veins myocardium by means of systemic injections of miRNAs. We estimate the possibility of project’s success as high, because the short list of miRNAs, which are supposed to be effective in pacemaking and working myocardium, already exists. 6 such candidate miRNAs will be studied in the project. It is known that the first 3 of them interfere with the product of genes responsible for pacemaking pattern of electrical activity, while other 3 inhibit the expression of genes which mediate the establishment of “working myocardium” electrical activity pattern. It is also supposed that the first group of miRNAs can suppress the ectopic activity in the arrhythmogenic myocardium. Thus, the success of the project will point the way to practical application of new endogenous cardioregulators for correction of pacemaker function as well as correction of arrhythmogenic patterns of bioelectrical activity. The research will be done using several laboratory animal species allowing the more complex investigation of various aspects of miRNA-mediated regulatory mechanisms. A complex of electrophysiological, biochemical and analytical methods will be used in the study. In vivo experiments on intact animals in combination with ex vivo experiments on isolated tissues and cells will help to reach the project’s goals. Such complex research of heart regulation by miRNAs have never been done before.

1. Будут получены данные о способности кардиоспецифических ранее отобранных микроРНК регулировать тканевое и биоэлектрическое формирование синоатриального узла (САУ) в ходе постнатального онтогенеза. Будут получены сведения о влиянии микроРНК с предполагаемой активностью на электрофизиологические свойства (конфигурация потенциалов действия, уровень потенциала покоя) пейсмекерного миокарда САУ и рабочего миокарда предсердий взрослых крыс, а также крысят возрастом 1, 7 и 21 день. Будут получены данные об эффективности шести микроРНК - miR-153, miR-198, miR-512-5p и miR-133a-3p, miR-429, miR-486-3p. Также будут получены данные о влиянии микроРНК на гистологические характеристики САУ и рабочего миокарда, в частности, на распределение белков щелевых контактов Сх30.8, Сх45 или Сх43, которые являются основными маркерами пейсмекерного или рабочего миокарда, соответственно. 2. С помощью техники пэтч-кламп в конфигурации whole-cell будет установлено, действительно ли экзогенные/внеклеточные микроРНК способны влиять на свои конечные мишени (ионные каналы) в пейсмекерных и рабочих предсердных кардиомиоцитах крысы или кролика. Эти мишени будут определены для каждого из 6 видов отобранных микроРНК. 3. Будут получены сведения о способности микроРНК модифицировать пейсмекерную активность синоатриального узла и биоэлектрическую активность рабочего миокарда при системном введении. Для решения данной задачи будет использована методика регистрации ЭКГ in vivo, а также техника микроэлектродных отведений для регистрации ПД в миокардиальных препаратах, изолируемых после эвтаназии. Будут получены данные о влиянии микроРНК на электрофизиологические характеристики in vivo с использованием минимум двух видов лабораторных животных, в том числе мини-свиней, так как их частота сердечных сокращений и другие электрофизиологические параметры максимально близки к таковым у человека. Будут получены данные при системном введении микроРНК на основе системы доставки на частоту сердечных сокращений, параметры ЭКГ, потенциалы действия в изолированных препаратах САУ и предсердий. Кроме того, в данной части работы впервые будет исследована способность микроРНК влиять на чувствительность САУ к вегетативной регуляции (чувствительность к симпатическим и парасимпатическим воздействиям). 4. Будут получены данные о способности экзогенных микроРНК влиять на проаритмические свойства миокарда, обладающего эктопической активностью (миокардиальной обкладки легочных вен). Такие результаты будут получены впервые. Известно, что миокард легочных вен является аритмогенный субстратом, благодаря тому, что у взрослых животных эта ткань приобретает способность спонтанно генерировать потенциалы действия, то есть приобретает свойства патологического эктопического пейсмекера, и в то же самое время, теряет электрофизиологические свойства рабочего миокарда (Haissaguerre M., Jais P., Shah D.C. N. Engl. J. Med. 339 : 659–666. 1998). Эти сведения позволяют предположить, что микроРНК, влияющие на экспрессию генов ионных каналов и транспортеров, отвечающих за пейсмекерный фенотип, будут оказывать действие на патологическую автоматию в легочных венах. Влияние микроРНК на биоэлектрическую активность легочных вен будет оцениваться в изолированных препаратах с помощью микроэлектродной техники с использованием двух видов животных: крыс и мышей С57bl6/CBA. Данный гибрид мышей будет использован, так как в нормальных условиях у взрослых, внешне здоровых особей ткань предсердий демонстрирует высокочастотную автоматическую активность. В серии экспериментов с миокардиальными препаратами крысы эффекты микроРНК будут выявляться на фоне адренергической стимуляции. Эти эксперименты позволят получить данные о потенциальной про- или антиаритмогенной активности экзогенных микроРНК.