ИСТИНА

Проект направлен на определение количественных характеристик связывания биологически активных веществ с наноалмазами детонационного синтеза и выявление влияния предварительной обработки наноалмазов на этот процесс. Будет исследовано поведение исходных и модифицированных наноалмазов в двухфазных системах вода-масло, моделирующих липидную мембрану, а также их взаимодействие с клеточными культурами. Для решения поставленной задачи будет использован метод радиоактивных индикаторов, реализованный с помощью меченных тритием органических соединений, полученных с помощью метода термической активации.

Application of tritium labeled substances for studying properties of nanodiamonds suspension that modified with biologically active compounds

1. С помощью меченных тритием соединений будут получены данные по необратимой адсорбции плюроника Р123 и гуминовых кислот угля на наноалмазах и определен состав образующихся композитов. Прочность связывания веществ с наноалмазами будет исследована в присутствии различных десорбирующих агентов. Будет исследовано изменение коллоидно - химические свойств (размер частиц, электрокинетический потенциал, седиментационная устойчивость) суспензий наноалмазов при их модификации указанными веществами. В каче стве характеристики липофильных свойств суспензий наноалмазов и модифицированных наноалмазов будет определено распределение наноалмазов между водной и органической фазами. В качестве последней будет использованы: октан, октанол, пара-ксилол. 2. Модернизированные плюроником или гуминовыми кислотами наноалмазы будут использованы для получения комплекса с лекарственным препаратом мирамистином. Будут определены: состав комплекса, прочность удерживания мирамистина, изменение коллоидно - химических свойств суспензий и их липофильность. 3. На клеточных культурах будет определено изменение токсичности мирамистина в составе композита с наноалмазами и параметры его связывания с клеточной мембраной. 4. Для выполнения проекта будут получены необходимые количества (10-100 МБк) меченных тритием наноалмазов и биологически-активных веществ (плюроник Р123, гуминовые кислоты угля, мирамистин), проведена их очистка и определена радиохимическая чистота. 5. Результаты будут опубликованы в рецензируемых журналах.

На кафедре радиохимии химического факультета разработаны оригинальные способы введения трития в химические соединения различных классов, в том числе в гуминовые вещества. Недавно разработан способ введения трития в наноалмазы. При участии руководителя проекта была разработана новая методика определения количества органических веществ, связывающихся как с порошками, так и с водными суспензиями наноалмазов при использовании меченных тритием соединений. С помощью разработанной методики исследована адсорбция гомопантотеновой кислоты и человеческого сывороточного альбумина на порошке наноалмазов и найдена изотерма адсорбции этих веществ в широком диапазоне концентраций. С помощью меченных тритием соединений найдена изотерма адсорбции мирамистина на наноалмазах в виде водной суспензии, определено изменение размера частиц суспензии и влияние на количество удерживаемого наноалмазами мирамистина в присутствии десорбирующих агентов. В дипломной работе руководителя проекта была разработана методика определения наноалмазов в растениях по радиоактивности меченных тритием наноалмазов. Были получены количественные данные о взаимодействии наноалмазов с корневой системой проростков пшеницы. Впервые в мире обнаружено, что наноалмазы способны погло щаться корневой системой и поступать в стебель и листья проростков пшеницы. Найдено, что гуминовые вещества оказывают влияние на этот процесс. Коллектив проекта работает сейчас над совершенствованием методики введения трития в наноалмазы, способов очистки и идентификации меченого продукта. В распоряжении коллектива есть оригинальное и современное оборудование: вакуумная установка для получения меченых соединений, хроматограф, жидкостной сцинтилляционный спектрометр для измерения радиоактивности. Имеется доступ к приборам коллективного пользования МГУ имени М.В. Ломоносова.

Аннотация, публикуемая на сайте Фонда (не более 1 стр.; для итогового отчета - описать содержание фактически проделанной работы и полученные результаты за весь период работы по Проекту) ★ Методом термической активации получены меченные тритием плюроник Р123, гуминовые кислоты угля, мирамистин, детонационные наноалмазы (ДН). Разработаны способы получения конъюгатов мирамистина с детонационными наноалмазами, модифицированных плюроником P123 и гуминовыми кислотами угля. С применением полученных меченных соединений изучены количественные характеристики образующихся комплексов, исследована прочность связывания веществ с наноалмазами в присутствии различных десорбирующих агентов. Обнаружено, что в присутствии мирамистина значительная часть адсорбированных плюроника Р123 и гуминовых кислот десорбируется. Полученные конъюгаты охарактеризованы с помощью спектроскопии динамического светорассеяния; с применением меченных тритием ДН определены коэффициенты распределения между водной фазой и органической жидкостью (октан, октанол, пара-ксилол), что моделирует сродство к клеточным мембранам; проведена оценка токсичности комплексов на колонии патогенного гриба Aspergilus Niger. Установлено, что разработанная методика позволяет создавать седиментационно и агрегативно устойчивые коллоидные растворы конъюгатов мирамистина с ДН, модифицированных плюроником P123 и гуминовыми кислотами угля. Установлено, что поверхностный слой гуминовых кислот на ДН не только увеличивает количество связываемого мирамистина из раствора, но и при этом позволяет сохранить его токсичность к колонии Aspergilus Niger. Тогда как в случае адсорбции мирамистина непосредственно на ДН, происходит полное подавление его токсичности. Полученные результаты могут быть полезны при разработке доставщиков лекарственных средств на основе ДН, а также при моделировании поведения ДН в окружающей среде. Важнейшие результаты, полученные в ходе реализации Проекта ★ Все заявленные в проекте цели выполнены полностью. Для модификации детонационных наноалмазов (ДН, «Синта» Беларусь) использовали: - коммерчески доступный препарат гуминовых кислот (CHA) Powhumus (Humintech GmbH, Germany) - неионногенное поверхностно-активное вещество (ПАВ) блок сополимер плюроник Р123. На модифицированных этими веществами ДН изучили адсорбцию катионного ПАВ бензилдиметил[3-(миристоиламино)пропил]аммонийхлорида. Производитель «Инфамед» РФ, торговое название «Мирамистин». Сравнение размеров агрегатов ДН в суспензиях проводили по максимуму и полуширине (FWHM) пика распределения диаметра частиц по их количеству (рисунок 1), полученного спектроскопией динамического рассеяния света. Комплексы ДН с биологически-активными веществами получали адсорбируя последние на суспензии ДН из водных растворов. Для определения состава комплексов ДН с исследуемыми веществами применяли меченные тритием соединения, которые получали методом термической активации трития, таблица 1. Таблица 1. Свойства препаратов, полученных методом термической активации трития вещество Ауд [3H]ДН 92 ГБк/г [3H]P123 0.16 ТБк/г [3H]мирамистин 72 ГБк/ммоль [3H]CHA 1.25 ТБк/г Рисунок 1: Распределение агрегатов наноалмазов по размеру: сплошная линия - ДН, штрихпунктирная линия - ДН-CHA и точечный пунктир - ДН-CHA-мирамистин; стрелочками показан расчет полуширины (FWHM) распределения. Полученные изотермы адсорбции представлены на рисунках 3 и 4. Экспериментальные данные были описаны уравнением (1), аналогичным уравнению Ленгмюра: (1) где Γ - адсорбция мг/г, Γмакс — максимальная адсорбция ммоль/г, c — концентрация адсорбата мМ, A — адсорбционная активность л/ммоль. Из полученных коэффициентов был оценен параметр равновесия P по уравнению: (2) Этот параметр определяет вид изотермы адсорбции и может быть использован для оценки термодинамической обратимости адсорбции. В работе были получены устойчивые суспензии агрегатов ДН, модифицированных гуминовыми кислотами угля или плюроником P123 и мирамистином (что в работе обозначается как ДНА-CHA, ДН-CHA-мирамистин, ДН-P123, ДН-P123-мирамистин). По данным динамического рассеяния света размер агрегатов в исследуемых системах не превышал 100 нм, таблица 2. Адсорбция гуминовых кислот в изученных системах (ДН в фосфатном буфере и ДН в дистиллированной воде) возрастала с увеличением концентрации вещества в растворе и достигала предельного значения при концентрации 50 мг/л. Было обнаружено, что в условиях эксперимента (фосфатный буфер рН 6.8; 25°С) гуминовые кислоты необратимо сорбируются на поверхности наноалмазов: десорбция гуминовых кислот фосфатным буфером была менее 10%. В случае гуминовых кислот угля, адсорбированных из водного раствора, остаточная адсорбция в всех изученных средах составила 20±1 мг/г. Следует отметить, что при адсорбции CHA на ДН происходит изменение знака ζ-потенциала на отрицательный и увеличение среднего диаметра частиц в суспензии, таблица 2. Таблица 2: Характеристики гидрозолей наноалмазов максимум, нм полуширина, нм ζ, мВ ДН 33 от 21 до 44 +34±7 ДН-CHA 70 от 54 до 103 −ζ* ДН-CHA-мирамистин 52 от 42 до 71 +ζ* ДН-P123 50 от 40 до 68 +33±3 ДН-P123-мирамистин 37 от 30 до 47 +27±6 ДН-О-мирамистин > 1 мкм - *пояснения в тексте Адсорбция мирамистина на модифицированных ДН Величина адсорбции мирамистина на ДН-CHA значительно выше, чем на немодифицированных наноалмазах, в области концентраций < 1 мМ. Причем количество адсорбированного мирамистина на ДН-CHA растет быстрее с увеличением концентрации до 1 мМ и достигает плато при концентрации 2 мМ. Можно предположить, что причиной является различие ДН и ДН-CHA по знаку электрокинетического потенциала. Молекула мирамистина в условиях эксперимента несет положительный заряд, что способствует увеличению взаимодействию с ДН-СНА, обладающими отрицательным знаком ζ-потенциала, рисунок 2. Полученные изотермы описаны уравнением (1), таблица 3. Из полученных коэффициентов рассчитали параметр равновесия по уравнению (2), рисунок 3. При адсорбции мирамистина на ДН-CHA происходит изменение знака ζ-потенциала с отрицательного на положительный и уширение сигнала. Рисунок 2: Изотермы адсорбции мирамистина на наноалмазах детонационного синтеза. Линии - расчет адсорбции мирамистина по уравнению 3: сплошная - ДН, штриховой пунктир - ДН-CHA, точечный пунктир - ДН-P123. Квадраты и круги - экспериментальные данные по адсорбции мирамистина на ДН-CHA и ДН-P123. Рисунок 3: Изменение параметра равновесия P в зависимости от концентрации мирамистина. Сплошная линия - при адсорбции мирамистина на наноалмазах; штриховой - на наноалмазах, модифицированных CHA; точечный - на наноалмазах, модифицированных P123. Таблица 3: Параметры адсорбции мирамистина на ДН адсорбент Γмакс, мкмоль/г А, л/ммоль R2 ДН 75±7 0.7±0.2 0.89 ДН-CHA 94±3 2.8±0.3 0.99 ДН-P123 45±9 0.41±0.16 0.92 Таблица 4: Десорбция мирамистина с поверхности наноалмазов в различных средах ДН-CHA ДН ДН-О ДН-P123 Величина остаточной адсорбции после 4-х суток, % H2O 78±4 71±1 75±5 95±5 фосфатный буфер 76±1 70±1 86±1 50±3 PBS 70±2 70±1 85±2 55±3 БСА 40 г/л 15±5 20±5 15±1 15±5 В присутствии мирамистина с поверхности ДН десорбируется P123, рисунок 4. Количество десорбируемого P123 растет с увеличением концентрации мирамистина до 2×10−3 М и не изменяется при дальнейшем увеличении концентрации, достигнув величины 72±2%, рисунок 4. Рисунок 4: Количество десорбированного плюроника P123 в присутствии мирамистина. Полученную изотерму адсорбции мирамистина на композите ДН с плюроником P123 в диапазоне 0.15×10−3 до 5.0×10−3 М концентраций описали уравнением (1). В результате многократного промывания осадка дистиллированной водой часть мирамистина десорбируется с поверхности ДН-Р123. Ресуспендировали в дистиллированной воде и определили, что дальнейшей десорбции в течение суток не происходит. Однако в присутствии альбумина с концентрацией 40 г/л удаляется 80% мирамистина с поверхности ДН, таблица 4. Адсорбционные слои мирамистина на композите ДН-P123 мало влияют на размер частиц, таблица 2, при этом ζ-потенциал остается положительным. Таким образом, с применением меченных тритием соединений достоверно определены составы конъюгатов ДН при последовательном связывании биологически-активных соединений с поверхностью ДН. Установлено, что модификация наноалмазов гуминовыми кислотами угля снижает коэффициент распределения ДН в системах вода - октанол и вода — п-ксилол, таблица 5. После взаимодействия ДН-CHA с мирамистином, коэффициент распределения в системе вода - октанол увеличивается и достигает значения исходного ДН. Модификация наноалмазов плюроником P123 значительно увеличивает коэффициент распределения. После взаимодействия ДН-P123 с мирамистином, коэффициент распределения в системе вода - октанол и вода - п-ксилол значительно снижается. В обоих случаях при этом по уравнению материального баланса значительная часть ДН концентрируется на границах раздела. Таблица 5: Коэффициенты распределения наноалмазов в системе вода-органическая жидкость Перераспределяемое вещество Органическая жидкость октан октанол п-ксилол ДН 0.009±0.002 0.13±0.01 0.026±0.002 ДН-CHA 0.006±0.002 0.023±0.003 0.003±0.002 ДН-CHA-мирамистин 0.005±0.002 0.15±0.01 0.005±0.002 ДН-P123 0.02±0.01 0.3±0.1 0.13±0.02 ДН-P123-мирамистин 0.024±0.001 0.170±0.014 - Оценку токсичности исследуемых препаратов мирамистина, наноалмазов и мирамистина сорбированного на наноалмазах осуществляли по отношению к колонии патогенного гриба Aspergilus Niger. Обнаружено, что размер колонии на 4-ые сутки в присутствии образцов исследуемых наноалмазов ДН-О и исходных ДН при концентрациях до 4 г/л значительно не отличался от размера колонии в контрольном препарате. Также не токсичен мирамистин сорбированный на наноалмазах ДН при концентрациях, в пересчете на свободный мирамистин, до 0.3 мМ. Следует отметить, что максимальный эффект подавления роста колонии свободный мирамистин проявляет при концентрации 32 μM и, с ростом концентрации до 0.32 мM, эффект не усиливается, рисунок 5. Рисунок 5: Оценка токсичности мирамистина на колонии гриба Aspergilus Niger Исследуемый образец ДН, в всем изученном диапазоне концентраций, в первые 24 часа замедляет рост, причем эффект соизмерим с воздействием концентрации мирамистина 32 μM. При дальнейшем анализе видно, что колония адаптируется к наличию высокой концентрации ДН в среде и рост мицелия усиливается, но при этом остается ниже контрольного варианта (сусло-агар). Поскольку мирамистин адсорбированный на наноалмазах не проявляет токсичности, а предварительная модификация поверхности плюроником P123 лишь уменьшает величину последующей адсорбции мирамистина на ДН, было принято решение добавить тестовый объект. Поэтому в работе использовали ДН окисленные кислородом воздуха (ДН-O) при нагревании до 450°С в течение 2 часов. В результате происходило изменение заряда поверхности частиц с положительного на отрицательный. Что приводило к значительному увеличению адсорбции мирамистина на наноалмазах. При отделении полученного комплекса ДН-O-мирамистин от маточного раствора и промывании водой происходила десорбция мирамистина. Тем не менее, полной десорбции не наблюдалось, и оставшаяся часть адсорбции по величине превосходила значение адсорбции мирамистина на ДН. Полученный композит ДН-O-мирамистин охарактеризовали аналогично ДН-CHA-мирамистин, таблица 2. Наноалмазы ДН-O с адсорбированным на поверхности мирамистином не образуют стабильных суспензий, при этом размер частиц увеличивается до 1 мкм и более. Добавление P123 к системе ДН-O-мирамистин не приводило к стабилизации суспензий при концентрациях P123 до 10−5 М. Гуминовые вещества, адсорбированные на ДН, при концентрации в системе 5 и 15 мг/л, что соответствует концентрации гуминовых веществ при оценке токсичности комплекса ДН-CHA-мирамистин, не оказывали влияние на рост и развитие гриба. Мирамистин, адсорбированный на наноалмазах, модифицированных гуминовыми кислотами угля, подавляет рост колонии патогенного гриба Aspergillus niger, однако в меньшей степени, чем свободный мирамистин. На рисунке 6 приведены результаты оценки роста колонии Aspergilus Niger в присутствии конъюгатов ДН с мирамистином (в пересчете на концентрацию свободного мирамистина 0.3 мМ), ДН-СНА-мирамистин (в пересчете на концентрацию свободного мирамистина 0.1 мМ); концентрация ДН в контроле составляла 4.2 г/л, концентрация CHA – 15 мг/л. Рисунок 6: Оценка токсичности ДН-О мирамистин, ДН-CHA-мирамистин, CHA и ДН на колонии гриба Aspergilus Niger. Можно предположить, что различие в токсическом действии комплексов мирамистина с наноалмазами связано с разными механизмами адсорбции мирамистина и прочностью его удерживания. • По-видимому, образование комплекса мирамистина с ДН происходит в основном за счет гидрофобных взаимодействий, что приводит к прочному удерживанию мирамистина, и снижению его токсичности в составе комплекса. • С поверхностью ДН-O и ДН-СНА в большей степени реализуется электростатическое связывание мирамистина, а гидрофобизация агрегатов наноалмазов способствует их связыванию с клеточной мембраной. При этом, в отличие от конъюгата ДН-мирамистин, реализуется другой механизм адсорбции, который позволяет иммболизированному мирамистину сохранять свою токсичность. Также возможно происходит медленное высвобождение мирамистина в процессе эксперимента с колониями гриба Aspergillus niger, что приводит к подавлению роста колонии. Для подтверждения этих предположений были проведены эксперименты по определению десорбции мирамистина с изучаемых комплексов и оценку гидрофобности конъюгатов ДН в модельных экспериментах. Остаточная адсорбция мирамистина в всех случаях (ДН-О-мирамистин, ДН-CHA-мирамистин и исходных ДН) близка в относительных единицах и составляет от 70 до 85% в воде и буферных системах, а в растворе альбумина ~15%. В модельных системах органическая фаза – вода было установлено, что иммобилизация мирамистина на поверхности всех изучаемых ДН приводит к увеличению распределения ДН в октанол. Для лучшего понимания процессов адсорбции на ДН провели сопоставление полученных данных с адсорбцией производных пантотеновой кислоты (ППК). Пантотеновая кислота (по номенклатуре ИЮПАК 3-[(2,4-дигидрокси-3,3-диметил-1-оксобутил)амино]пропановая кислота) представляет собой амид 3-аминопропановой и пантоевой кислот и содержит в своем составе карбоксильную и гидроксильные группы (HO—R—COOH). 4'-фосфо-пантотеновая кислота (HO)2P(=O)—O—R—COOH). Третье производное – гопантеновая кислота (HO—R—CH2—COOH), которая обладает дополнительным звеном в углеводородной цепочке (4-аминомасляная кислота). Мирамистин и все используемые ППК обладают фрагментом - NH-C(O) -, однако отличаются от него меньшей длинной углеводородного скелета. Между собой эти производные отличаются длиной углеводородного скелета и наличием функциональной группы. Эксперименты по адсорбции ППК на ДН проводили из водного раствора и 0,9% раствора NaCl. Изотермы адсорбции описали уравнением 3. Подтверждением участия ионных взаимодействий в адсорбции исследуемых веществ является значительное уменьшение адсорбции в экспериментах при повышенной ионной силе. Оказалось, что в 0,9% растворе NaCl существенно снижался коэффициент А в уравнении (3), описывающем изотерму адсорбции, а величина Гмакс для ПК и ГПК мало отличалась. Гидрофобная составляющая адсорбции также играет важную роль, что наблюдается в сопоставлении результатов для ПК и ГПК. При примерно одинаковой величине Гмакс параметр А выше у ГПК как при адсорбции в воде, так и в 0,9% NaCl. Сопоставление результатов, полученных в ходе реализации с мировым уровнем ★ Полученные результаты являются новыми и полностью соответствуют мировому уровню, что подтверждается публикациями в рецензируемых журналах и докладами на международных и всероссийских конференциях. Живой интерес к результатам работы и плодотворное обсуждение с участниками конференции свидетельствует об актуальности и соответствии полученных данных мировому уровню. Методы и подходы, использованные в ходе реализации Проекта (описать, уделив особое внимание степени оригинальности и новизны) ★ Получение меченных тритием соединений проводили по методу термической активации трития, который заключается в активации газообразного трития на нагретой вольфрамовой проволоке. Подготовку мишени проводили следующим образом: приготовленный раствор вещества наносили на стенки реакционного сосуда и распределяли равномерно, замораживали в жидком азоте, затем лиофилизовали. Реакционный сосуд присоединяли к установке для работы с газообразным тритием и вакуумировали до давления 0.01 Па. Затем, пропуская через Pd-фильтр, наполняли тритий-протиевой смесью до давления 0.5 Па, при этом охлаждали весь реакционный сосуд жидким азотом. В работе использовали смесь газообразного трития и протия (ПО «Маяк», РФ), соотношение изотопов водорода определяли в контрольных экспериментах. Все данные по радиоактивности представлены в пересчете на 100% трития в газовой смеси. Реакцию проводили при нагревании вольфрамовой проволоки электрическим током в течение 10 с. В случае, если процедуру повторяли, то перед каждым воздействием остаточный газ удаляли и систему наполняли новой порцией газовой смеси. Анализ и очистка продукта подробно описаны в соответствующих разделах. Наноалмазы детонационного синтеза В работе использовали детонационные наноалмазы (ДН) производства «Синта», Беларусь. Перед применением ДН были охарактеризованы ИК-спектроскопией на приборе на приборе Protege 460 (Nicolet), в диапазоне частот 4000 ‑ 400 см-1, рисунок 1. Для этого навеску наноалмаза растирали с высушенным KBr, спрессовывали в таблетку, которую помещали в прибор. В ИК-спектре поглощения присутствует интенсивная широкая полоса с максимумом 3433 см-1, которая обусловлена колебаниями O-H-связей молекул воды, адсорбированной на поверхности наноалмаза или матрицы KBr. Полосы в области 2920 и 2851 см-1 соответствуют области валентных колебаний C‑H-связей. Полоса поглощения с максимумом при 1723 см-1 связана с колебаниями >С=О связи в поверхностных карбоксильных и карбонильных группах, а при 1103 см-1 – колебаниям связей подобных эфирным. При 1628 см-1 наблюдаются деформационные колебания изолированных поверхностных ОН-групп и в сорбированных молекулах воды. Рисунок 1. ИК-спектр детонационных наноалмазов «Синта». Далее готовили суспензию ДН с концентрацией 5 г/л в деионизированной воде, очищенной способом Milli-Q. Затем проводили ультразвуковую обработку (ультразвуковая ванна ГРАД 28-35, 110 Вт) в течение 2 часов и термостатировали суспензию сутки при 4°C. Верхнюю часть суспензии (90% объема, исключая осадок) отбирали в колбу и высушивали на роторном испарителе, фиксируя массу сухого остатка. Добавляли воду и подвергали ультразвуковой обработке 4 часа. Приготовленная таким образом суспензия стабильна в течение как минимум недели. В рамках настоящего проекта показано, что удельная активность меченных тритием НД определяется размерами агрегтов НД в водной суспензии. Удельная радиоактивность меченных тритием наноалмазов при получении методом термической активации может быть повышена в результате предварительной дополнительной обработки ультразвуком, в том случае, если такая обработка приводит к уменьшению диаметра агрегатов детонационных наноалмазов в водных суспензиях в два и более раз. Подготовка мишени и введение трития проводили методом термической активации трития. Суспензию НД лиофильно высушивали на стенках реакционного сосуда. Сухое количество ДН, взятое на мишень, составило от 0.2 до 0.6 мг в объеме 0.8-1.0 мл коллоидного раствора. После вакуумирования систему наполняли тритий-протиевой смесью до давления 1.3 Па, содержание трития составляло от 10 до 25%. Реакцию проводили в течение 10 с при температуре вольфрамовой проволоки 2000 К. Дно реакционного сосуда охлаждали жидким азотом. Процедуру проводили 2 раза. Продукт реакции растворяли в 4 мл (2 порции по 2 мл) деионизированной воды. Отбирали часть раствора для измерения скорости счета. Через 24 ч при комнатной температуре проводили высушивание на роторном испарителе для удаления трития из лабильных положений. К остатку добавляли 2 мл воды и проводили измерение скорости счета аликвоты раствора. Концентрацию полученного коллоидного раствора ДН определяли спектрофотометрически. Удельная радиоактивность полученного препарата составила 3.7·1012 Бк/г. Бензилдиметил[3-(миристоиламино)пропил]аммонийхлорид Количество мирамистина, взятое на мишень, составило 0.8 мг. Содержание трития в газовой смеси 84%, температура вольфрамовой проволоки 1800 К. Весь реакционный сосуд охлаждали жидким азотом. После реакции мирамистин со стенок колбы смывали водой (2 порции по 2 мл), переносили в круглодонную в колбу объемом 10 мл и проводили измерение скорости счета. Затем для удаления лабильной метки раствор полностью осушили на роторном испарителе, растворили в 1 мл воды, снова измерили радиоактивность. Анализ [3H]мирамистина проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках Sigma Aldrich в системе хлороформ:этанол:аммиак в соотношении 11:21:6 по объему. Положение вещества на пластинке фиксировали под ультрафиолетом, а также сканированием узкой полоски хроматограммы меченного соединения на сканере BetaChrom. Радиохимическая чистота составила 95% по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии. Анализ проводили с помощью хроматографической системы Agilent 1200 HPLC, колонка 0.46×15 см Eclipse XDB-C8 (5μm), 298 K. В качестве подвижной фазы использовали линейный градиент воды, ацетонитрила и 1% трифторуксусной кислоты, скорость потока 1.5 мл/мин. Регистрацию проводили по УФ-поглощению при длине волны 260 нм. Время удерживания мирамистина составило 3.4 мин. Собирали фракции по 0.5 мин и измеряли их радиоактивность. Удельная радиоактивность препарата [3H]мирамистина составила 7.2·1010 Бк/ммоль. Плюроник P123 Раствор 1.0 мг P123 в этаноле наносили равномерно на стенки реакционного сосуда и высушивали на воздухе. Содержание трития в реакционной смеси составило 30%, температура вольфрамовой проволоки - 1890 К. Весь реакционный сосуд охлаждали жидким азотом. После реакции вещество со стенок колбы смывали этанолом (2 порции по 2 мл), переносили в круглодонную в колбу объемом 10 мл. Раствор через сутки полностью осушили на роторном испарителе, растворили в 1 мл этанола, снова измерили радиоактивность. Анализ препарата [3H]P123 проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках Silufol, система хлороформ:метанол в соотношении 13:1 по объему. Положение вещества на пластинке фиксировали в иодной камере, Rf = 0.18. При очистке препарат меченого соединения растворяли в 0.2 мл H2O, наносили на стартовую линию по всей ширине пластинки и проводили хроматографию. Положение вещества на пластинке определяли с помощью хроматографии исходного соединения в тех же условиях, а также сканированием узкой полоски хроматограммы меченого соединения на сканере BetaChrom. Силикагель из области пластинки с веществом перенесли во флакон и элюировали вещество в 3 мл метанола. Радиохроматография очищенного препарата показала, что его радиохимическая чистота составляет 93%. Удельная радиоактивность препарата [3H]P123 составила 1.6×1011 Бк/ммоль. Гуминовые вещества Раствор гуминовой кислоты (1 мл, 0.3 г/л) в 0.5 мМ NaOH равномерно наносили на стенки цилиндрического реакционного сосуда и лиофилизовали. Реакционный сосуд с мишенью ГК подключали к установке для работы с газообразным тритием и вакуумировали, затем наполняли сосуд тритием до давления 0.5 Па. Вольфрамовую нить, расположенную в центре сосуда, электрическим током нагревали до температуры 1950 К. При этом весь реакционный сосуд охлаждали жидким азотом. Остаточный газ удаляли, мишень смывали порциями по 2 мл фосфатного буфера (состав: Na2HPO4 8.0 мМ, K2HPO4 2.0 мМ, NaN3 8.0 мМ, pH 6.8). Для удаления трития из лабильных положений (OH-, COOH-, NHn- и др.) проводили диализ при 277 K через диализные мембраны 2000-12000 Да против 0.028 М фосфатного буфера. Анализ гуминовых веществ проводили с помощью гель-фильтрации на хроматографической системе Abimed. Система состоит из ВЭЖХ насоса, автосэмплера, стеклянной колонки (25 мм×25 см) и снабжена спектрофотометрическим УФ-детектором. Использовали колонку, заполненную гелем «Toyopearl» TSK HW-55S (Toso-Haas, Япония). В качестве подвижной фазы использовали по 0.028 M фосфатный буфер (рН 6.8). УФ-поглощение элюата детектировали при 254 нм. Удельная радиоактивность препарата [3H]CHA после очистки составила 1.25 ТБк/г, выход - 84%. Получение конъюгатов детонационых наноалмазов ДН с биологически-активными веществами. Изучение адсорбции на ДН исследуемых веществ проводили с применением полученных меченными тритием соединениями. Эксперимент проводили по следующей схеме. Подготовили и охарактеризовали суспензии наноалмазов. Приготовили раствор исследуемого вещества, добавили радиоактивный индикатор. Затем проводили смешение растворов и термостатировали их до достижения системой равновесия. Проводили центрифугирование и измеряли скорость счета раствора над осадком и по уравнению (1) определяли равновесную концентрацию исследуемого вещества. Маточный раствор удаляли и заменяли новой порцией растворителя. Цикл центрифугирование - замена надосадочного раствора проводили несколько раз контролируя радиоактивность промывного раствора. Затем к осадку добавляли жидкий сцинтиллятор и проводили измерение скорости счета каждые 24 часа до тех пор, пока скорость счета препарата не начинала сходиться. Из полученной радиоактивности осадка рассчитывали величину необратимой адсорбции согласно уравнению (2). Для определения прочности удерживания адсорбированного вещества эксперимент по адсорбции повторяли полностью и, вместо добавления жидкого сцинтиллятора, к осадку наноалмазов добавляли раствор, в котором после достижения системой равновесия определяли величину остаточной адсорбции. (1) (2) где aост - радиоактивность раствора после отбора промывного раствора, aуд-удельная радиоактивность исходного раствора, m-масса навески наноалмаза, I - скорость счета β-излучения трития, ε-эффективность регистрации, V-объем аликвоты, c0 - начальная концентрация, Vо - объем раствора. Модифицированные ДН, отделенные от маточного раствора, несколько раз промывали деионизированной водой. Затем определяли величину остаточной адсорбции в различных средах. Для этого к остатку добавляли H2O, фосфатный буфер (pH 6.8, состав: Na2HPO4 8.0 мМ, K2HPO4 2.0 мМ, NaN3 8.0 мМ), натрий-фосфатный буфер (PBS, pH 6.8, состав: Na2HPO4 8.0 мМ, K2HPO4 2.0 мМ, NaN3 8.0 мМ, NaCl 15.5 мМ), мирамистин (7 мМ) или альбумин (до концентрации 40 г/л) для изучения десорбции и гомогенизировали образец перемешиванием. После достижения равновесия в системе, наноалмазы отделяли от маточного раствора центрифугированием. К осадку добавляли сцинтилляционную жидкость и проводили измерение скорости счета с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Гуминовые кислоты Для гуминовых кислот угля CHA (раствор натриевой солей) эксперимент проводили в фосфатном буфере (состав: Na2HPO4 8.0 мМ, K2HPO4 2.0 мМ, NaN3 8.0 мМ, pH 6.8) и в дистиллированной воде в отсутствии буфера. Адсорбцию CHA изучали в диапазоне концентраций от 30 до 200 мкг/мл. К растворам [3H]CHA добавляли суспензию наноалмазов, содержащую около 1 мг дисперсной фазы. Радиоактивность приготовленных растворов [3H]CHA составила 37 МБк/л. Суспензии термостатировали при температуре 25°C в течение 2-3 суток. Определение адсорбции гуминовых кислот проводили по методике аналогичной, описанной в предыдущем пункте. Бензилдиметил[3-(миристоиламино)пропил]аммоний хлорид моногидрат Для проведения адсорбционных экспериментов использовали раствор меченного тритием мирамистина с концентрацией 6.6 г/л и удельной активностью 0.173 ГБк/л. Изучение адсорбции проводили на модифицированных гуминовыми кислотами угля ДН в диапазоне концентраций от 0.15 до 5 мМ. Модификацию проводили адсорбцией CHA из водного раствора при концентрации CHA 60 мг/л. Количество CHA в системе определяли расчетом по данным адсорбции CHA на ДН, полученным с применением [3H]CHA. Для достижения равновесной концентрации мирамистина суспензии выдерживали в течение 2-х суток при температуре 25°С. Для определения количества сорбированного мирамистина супернатант отбирали практически полностью, осадок несколько раз промывали водой, измеряя скорость счета промывного раствора. К полученному осадку добавляли 5 мл сцинтилляционной жидкости Ultima Gold, и измеряли скорость счета каждые сутки, до постоянства скорости счета. Присутствующие в сцинтилляторе поверхностно-активные вещества способствовали десорбции мирамистина с наноалмаза. Приготовление композиционных материалов [3H]ДН-CHA-мирамистин и [3H]ДН-плюроник Р123 Готовили композит [3H]ДН-CHA таким образом, чтобы количество прочно связанной CHA было максимальным. Модифицированные наноалмазы, отделенные от маточного раствора, несколько раз промывали деионизированной водой. К полученному композиту [3H]ДН-CHA добавляли мирамистин с концентрацией 2.5 мМ. После достижения системой равновесия маточной раствор удаляли и осадок промывали дистиллированной водой. Далее композит [3H]ДН-CHA, модифицированный мирамистинином, обозначается как [3H]ДН-CHA-мирамистин. Приготовили композит ДН с P123 таким образом, чтобы количество прочно связанного P123 было максимальным. Провели удаление маточного раствора. Модифицированные таким способами наноалмазы использовали для изучения распределения ДН между водной и органическими фазами. Приготовление систем суспензия ДН - органическая фаза. Суспензии [3H]ДН (исходных, или модифицированных) готовили с концентрацией 0.2 г/л. Добавляли 1 мл органической жидкости (октан, октанол или п-ксилол) и после интенсивного перемешивания в течение 5 минут оставляли при комнатной температуре. На следующие сутки определили коэффициент распределения, как отношение радиоактивностей органической и водной фаз. Изучение токсичности препаратов по отношению к Aspergillus niger Оценку токсичности исследуемых препаратов мирамистина, наноалмазов и мирамистина сорбированного на наноалмазах осуществляли путем введения препаратов в агаризованную питательную среду. В качестве питательной среды использовали 4% пивное сусло и 2% агар, который остужали до 50°С с последующим внесением необходимого количества анализируемого препарата. Полученную среду с исследуемым препаратом, в количестве 5 мл быстро и тщательно перемешивали, затем переносили в стерильные чашки Петри диаметром 6 см. Далее на агаризованную среду помещали суспензию спор гриба Aspergillus niger, в количестве 20 мкл, приготовленную при помощи смыва спор стерильной водой. Количество спор в 20 мкл составило 10−6. Рост культуры проводили при 28°С в течение 4 сут. Скорость роста оценивали при помощи линейки в миллиметрах, от края капли внесенного инокулята споровой суспензии. Повторность трехкратная. Участие в научных мероприятиях по тематике Проекта за период, на который предоставлен грант (каждое мероприятие с новой строки, указать названия мероприятий и тип доклада) Международная конференция со школой и мастер-классами для молодых учёных "Химическая технология функциональных наноматериалов", Москва, Россия, 30 ноября - 1 декабря 2017, устный 13th International Conference Advanced Carbon NanoStructures – 2017 (ACNS'2017), Санкт-Петербург, Россия, 3-7 июля 2017, стендовый XXIV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2017», устный 27th International Conference on Diamond and Carbon Materials, Le Corum, Montpellier, Франция, 4-8 сентября 2016 , стендовый 10-я Международная конференция «Углерод: фундаментальные проблемы науки, материаловедение, технология», Троицк, Россия, 6-9 июня 2016, стендовый Библиографический список всех публикаций по Проекту, опубликованных за период, на который предоставлен грант, в порядке значимости: монографии, статьи в научных изданиях, тезисы докладов и материалы съездов, конференций и т.д. 1. Влияние плюроника Р123 на распределение частиц наноалмазов в системах вода/органическая жидкость / О. А. Соболева, М. Г. Чернышева, И. Ю. Мясников и др. // Журнал физической химии. — 2017. — Т. 91, № 1. — С. 129–135. 2. Role of pre-sonication of nanodiamonds hydrosols in radiolabelling by means of tritium thermal activation method / I.Yu. Myasnikov, A.V. Gopin, I.V. Mikheev et al. // сдано в редакцию журнала Mendeleev Communications 3. Нековалентная модификация наноалмазов меченными тритием производными пантотеновой кислоты / И.Ю. Мясников, Г.А. Бадун, А.Г. Казаков et. al. // сдано в редакцию журнала Радиохимия 4. Влияние условий подготовки наноалмазов на их удельную радиоактивность при введении трития с помощью метода термической активации / И.Ю. Мясников // Сборник тезисов докладов в XXIV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2017», Москва. 2017. 5. Влияние окислительной модификации поверхности наноалмазов на адсорбцию поверхностно-активных веществ / М.Э. Алексеев, И.Ю. Мясников // Сборник тезисов докладов в XXIV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2017», Москва. 2017. с. 679. 6. Влияние модификации поверхности наноалмазов детонационного синтеза на их токсичность / И.Ю. Мясников, О.И. Кляйн, Н.А.Куликова, М.Г. Чернышева, Г.А. Бадун // Cборник тезисов докладов в Международная конференция со школой и мастер-классами для молодых учёных "Химическая технология функциональных наноматериалов", Москва, Россия, 2017. с. 642. 7. Influence of nanodiamonds modification by biologically active compounds on the physical chemical properties of suspensions / I.Yu Myasnikov, M.G. Chernysheva, G.A. Badun // Book of Abstracts 13th International conference Advanced Carbon Nanostructures (ACNS'2017), St. Petersburg, Russia, 2017. с. 184. 8. Tritium labeled nanodiamonds: preparation and application in studying its behavior in liquid-liquid and biological systems / I. Yu Myasnikov, M. G. Chernysheva, O. A. Soboleva et al. // Abstract book: 27th International Conference on Diamond and Carbon Materials (ICDCM). 2016. Pp. 27–27. 9. Изменение коллоидно-химических свойств наноалмазов при их модификации плюрониками / И. Ю. Мясников, М. Г. Чернышева, О. А. Соболева, Г. А. Бадун // Сборник тезисов докладов 10 Международной конференции Углерод: фундаментальные проблемы науки, материаловедение, технология. Москва, г. Троицк, 2016. С. 296–297. 10. Адсорбция биологически активных веществ на наноамазах детонационного синтеза / Мясников И. Ю., Чернышева М. Г., Бадун Г. А. // Сборник тезисов докладов 10 Международной конференции Углерод: фундаментальные проблемы науки, материаловедение, технология. Москва, г. Троицк, 2016. С. 290–291.