ИСТИНА

Известно, что субъединичный состав SWI/SNF комплексов может оказывать существенное влияние на экспрессию генов в процессе развития и дифференцировки клеток. В данном проекте планируется изучить роль замены субъединиц комплекса SWI/SNF в процессе дифференцировки промиелоцитов человека в нейтрофилы. Для этого исследуется и сравнивается содержание белков комплекса в раковой линии промиелоцитарного лейкоза HL-60, дифференцированных из нее миелоцитах и нейтрофилах человека.

Neutrophils - polymorphonuclear leukocytes, that provide the primary non-specific immune response. Differentiation of neutrophils occurs in the bone marrow from hematopoietic stem cells via the myeloid way. Mistakes in this process can lead to serious diseases, such as various forms of leukemia. The chromatin remodelling complex SWI/SNF (PBAF) control the transcription of genes and influence differentiation of cells. PBAF complex is also involved in the development of neutrophils from promyelocytes and changes during this process. The aim of this work was to study the subunit composition of PBAF complex and its influence on the expression of genes during the differentiation of human promyelocytes to neutrophils.

В рамках проекта мы планируем изучить роль замены субъединиц комплекса SWI/SNF в процессе дифференцировки промиелоцитов человека в нейтрофилы. Работа будет проводиться на модели раковой линии HL-60, дифференцированных из нее миелоцитов и нейтрофилов, выделенных из крови здоровых доноров. Будут решены следующие задачи: 1. Изучен уровень экспрессии субъединиц комплекса SWI/SNF (подсемейства PBAF), на разных стадиях дифференцировки промиелоцитов в нейтрофилы. 2. Изучен субъединичный состав комплекса PBAF на разных стадиях дифференцировки нейтрофилов. Особое внимание будет уделено наличию в комплексе изоформ субъединицы PHF10, так как они оказывают различное влияние на пролиферативные способности клеток. 3. Будет изучено влияние комплекса SWI/SNF на транскрипцию генов на каждой стадии дифференцировки.

В отделе биокинетики НИИФХБ им. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова была налажена работа с полиморфоядерными лейкоцитами человека, выделенными из цельной крови здоровых доноров, а также поставлены методики определению уровня апоптоза, специфических маркеров и внутриклеточных белков методами цитофлуориметрии и спектрофотометрии. Также ведется линия раковых промиелоцитов человека HL-60. Ранее в лаборатории транскрипционных факторов эукариот ИБГ РАН был охарактеризован ген млекопитающих PHF10, играющий важную роль в активации генов. Было обнаружено и доказано, что этот белок помимо основной консервативной формы PHF10-P ген кодирует еще одну консервативную форму – PHF10-S. Оба типа изоформ входят в состав SWI/SNF комплекса, ремоделирующего хроматин. Однако функционально комплексы, содержащие различные изоформы отличаются. SWI/SNF комплексы, содержащие PHF10-P изоформы способствовали пролиферации клеточной линии HEK293, а комплексы, содержащие PHF10-S изоформы — не оказывали никакого влияния на пролиферацию. Мы предположили, что SWI/SNF комплексы разного субъединичного состава могут быть важны при пролиферации и дифференцировке клеток крови по миелоцитарному пути. У нас имеются полученные охарактеризованные ранее специфические антитела к субъединицам SWI/SNF комплекса Brg1, Brd7, BAF155, BAF180, BAF200, а также антитела к общему PHF10 и изоформам PHF10-P для выполнения экпериментов по цитофлуореметрии, Вестерн-блоттингу, ко-иммуннопреципитации и хроматин-иммуннопреципитации.

Полученные в 2016 году результаты с описанием методов и подходов, использованных в ходе выполнения проекта: 1. При помощи световой микроскопии и обратной ПЦР было показано, что под действием 2 мМ транс-ретиноевой кислоты происходит дифференцировка клеток линии HL-60 в нейтрофилы. Результат ярко выражен по изменению морфологии клеток (появление сегментоядерности), экспрессии специфических маркеров CD66a и CD66b в дифференцированных клетках, а также уменьшении экспрессии гена Cyclin D1, т.к. конечно дифференцированные клетки теряют способность к пролиферации. 2. При помощи проточной цитофлуориметрии (измерение содержания внутриклеточных белков с использованием первичных кроличьих и флуоресцентно меченных вторичных антител) и обратной ПЦР (определение экспрессии белков по мРНК) было показано, что происходит падение содержания субъединиц белков SWI/SNF комплекса в ряду HL-60 (недифференцированные) – HL-60 (дифференцированные) – нейтрофилы (выделенные из крови здоровых доноров). 3. Субъединица PHF-10 имеет 4 изоформы, по экспрессии мРНК было показано, что в ходе дифференцировки клеток помиелоидному пути из линии HL-60 под действием 2 мМ транс-ретиноевой кислоты происходит замена изоформы PHF10-Pl на PHF10-Ss. 4. При помоши вестерн-блоттинга и коиммунопреципитации доказали, что в нейтрофилах и клетках линии HL-60 качественный состав субъединиц комплекса один и тот же, однако иммунопреципитация изоформ субъединицы PHF10 из лизатов нейтрофилов и HL-60 показала, что в нейтрофилах экспрессируются PHF10-Ps и Ss изоформы, в пролиферирующих HL-60 эксперессируются PHF10-Pl и Sl.