Мультилипосомальные носители лекарственных веществ на основе полимерных микрогелейНИР

Multifunctional liposomal containers based on polymeric microgels

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Мультилипосомальные носители лекарственных веществ на основе полимерных микрогелей
Результаты этапа: Анионные микрогели получали добавлением водного раствора ZnCl2 к водному раствору карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) со средней молекулярной массой 90.000. Мольное отношение карбоксильных групп КМЦ к ионам металла N = [COO-]/[Zn(2+)] варьировалось от 20 до 3. Полученные смеси диализовали против дистиллированной воды и лиофильно сушили. Для образцов с N от 20 до 5 наблюдалось количественное связывание полимером двухвалентных ионов цинка: весь добавленный цинк связывался с макромолекулами КМЦ. Образцы с N от 20 до 5 растворялись в воде с образованием прозрачных растворов. В разбавленном растворе исходной КМЦ регистрировались частицы с гидродинамическим диаметром 480 нм. При связывании КМЦ с ионами цинка размер частиц в системе уменьшался до 175 нм и мало зависел от содержания Zn(2+). Электрофоретическая подвижность (ЭФП) таких «ионно-сшитых» макромолекул (микрогелей) в буфере с рН 7 составила -2.7 (мкм/с)/(В/см). Микрогели на основе альгината натрия (АЛГ) с молекулярной массой 3.000.000 формировали с участием солей Zn (2+), Ca(2+), Fe(3+), Cr(3+) и Ce(4+) в качестве сшивающих агентов. Во всех случаях отношение N = [COO-]/[Mе(n+)] составляло 20. После растворения в воде буфере Трис с рН 7 получались частицы микрогелей с гидродинамическим диаметром около 190 нм. Помимо этого в работе были использованы коммерчески доступный альгинатный микрогель, «сшитый» ионами ионами Ca(2+), и ковалентно сшитый микрогель, полученный сополимеризацией анионной акриловой кислоты (АК), электронейтрального N-изопропилакриламида (НИПАМ) и сшивателя N,N`-метиленбисакриламида. Тройной сопополимер со звеньями акриловой кислоты, ТС(-), растворялся в воде с образованием частиц микрогеля с гидродинамическим диаметром 210 нм. Липосомы получали ультразвуковой обработкой водной суспензии смеси липидов, состоявшей из электронейтрального яичного лецитина (ЯЛ) или диолеоилфосфатидилхолина (ДОФХ) и анионного фосфатидилсерина (ФС1-). Мольную долю анионного липида в смеси v= [ЯЛ]/([ЯЛ]+[ФС1-]) или [ДОФХ]/([ДОФХ]+[ФС1-]) варьировали от 0,1 до 0,3. В работе также использовали липосомы со встроенным в мембрану флуоресцентно меченным липидом – диолеоилфосфоэтаноламином, модифицированным родамином (ДОФЕ-Род), и липосомы, внутренний объем которых был заполнен водными растворами хлорида натрия или цисплатина (ЦП), или противоопухолевого антбиотика доксорубицина (Докс). Размер полученных липосом варьировался от эксперимента к эксперименту, но всегда оставался в пределах 45-70 нм. Тройные комплексы анионного микрогеля с катионным полимером формировали путем электростатического связывания ионно-сшитого анионного АЛГ/Са (N = 20) с катионым полимером, поли-L-лизин гидробромидом (ПЛ) с молекулярной массой 150.000-300.000. Добавление раствора ПЛ к раствору микрогеля сопровождалось нейтрализацией заряда частиц микрогеля и их агрегацией. Нулевой заряд и формирование агрегатов максимального размера наблюдались при эквимольном соотношении свободных (не связанных с ионами Са) карбоксилатных групп АЛГ и катионных групп ПЛ. Дальнейшее увеличение концентрации ПЛ приводило к перезарядке комплекса АЛГ/Са – он приобретал положительный заряд. Перезарядка сопровождалась уменьшением частиц тройного комплекса АЛГ/Са/ПЛ, в избытке ПЛ размер тройного комплекса был практически равен размеру частиц исходного микрогеля. Метод кругового дихроизма показал, что ионы Са(2+) в комплексе АЛГ/Са преимущественно связывались с гулароновыми (G) блоками альгината. ПЛ не формировал вторичных структур (альфа-спиралей и бета-слоёв) на поверхности микрогелей АЛГ/Са. Кривые малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) ионно-сшитого АЛГ/Са и композита АЛГ/Са с наночастицами оксида железа (маггемита) демонстрировали рассеяние от полидисперсных систем. Введение маггемита сопровождалось повышением упорядоченности в образце, что было связано с дополнительным сшиванием матрицы АЛГ наночастицами маггемита.. Анализ полидисперсности образцов показал, что решающий вклад в распределение вносят частицы с размером 110Ǻ, который соответствует расстоянию между узлами сетки микрогеля в композите. Для формирования мультилипосомальных коньюгатов (МК) использовали тройной комплекс АЛГ/Са/ПЛ с положительным зарядом и отрицательно заряженные липосомы с мольной долей анионного липида ν от 0,1 до 0,3. В всех случаях добавление липосом сопровождалось нейтрализацией заряда частиц тройного комплекса. Повышение концентрации липосом сверх нейтрализующей приводило к формированию отрицательно заряженных частиц в системе. В избытке липосом размер МК был минимальным и составлял 400 нм. МК получали также путем связывания анионных липосом с микрогелем на основе тройного сополимера, полученного из катионного мономера (10 мол%), электронейтрального НИПАМ и сшивателя (от 2 до 8 мол%.) Тройной сополимер с катионными звеньями, ТС(+), был получен и охарактеризован в лаборатории проф. Рихтеринга. Количественное связывание липосом наблюдалось вплоть до насыщения поверхности микрогеля адсорбированными липосомами. Максимальное количество связанных липосом определялось только содержанием катионных групп в микрогеле и не зависело от доли сшивателя. Целостность анионных липосом в комплексе с микрогелями АЛГ/Са/ПЛ и ТС(+), заполненных растворами Док с NaCl, оценивали с помощью методов флуоресценции и кондуктометрии, соответственно. Формирование комплексов липосом с микрогелями не сопровождалось вытеканием Докс и соли из липосом, то есть не приводило к появлению дефектов в липосомальной мембране (нарушению ее целостности). Устойчивость МК в водно-солевых растворах исследовали методом флуоресценции. Добавление катионного микрогеля АЛГ/Са/ПЛ к флуоресцентно меченным липосомам приводило формированию МК и тушению флуоресцении метки. Последующее добавление NaCl в раствор МК давало разные результаты в зависимости от содержания анионного липида в липосомальной мембране (значения ν). Раствор МК, сформированного липосомами с ν = 0,1, сохранял затушенный уровень флуоресценции до концентрации соли равной 0,08 М, однако дальнейшее повышение концентрации соли вызывало возгорание флуоресценции метки, то есть диссоциацию МК на липосомы и катионный микрогель. Увеличение доли анионного липида в липосомах до ν = 0,2 обеспечивало стабильность МК в физиологическим растворе с [NaCl] = 0,15 М. Таким образом, МК, сформированные катионными микрогелями и липосомами с ν = 0,2 и выше, являются перспективными носителями биологически активных веществ (БАВ). Для визуализации мультилипосомальных конъюгатов был использован метод криогенной трансмиссионной электронной микроскопии (крио-ТЭМ). Исходные липосом заполняют на микрофографии все поле, они изолированы друг от друга и не деформированы. На микрофотографии конъюгата липосом с микрогелем АЛГ/Са/ПЛ видны скопления липосом, которые отражают их объединение вокруг центральной частицы микрогеля. Сам микрогель плохо различим из-за его низкой контрастности. Для лучшей визуализации конъюгата целесообразно использовать микрогель с иммобилизованными наночастицами маггемита. Для оценки цитотоксичности липосом и наноконъюгатов использовали стандартный MTT-тест. В качестве количественной меры цитотоксичности использовали значение концентрации добавленного вещества, при которой наблюдается гибель 50% клеток (LC50). Более высокое значение LC50 означало меньшую цитотоксичность образца. Липосомы не проявляли цитотоксического действия вплоть до концентрации 10 мг/мл; линейный АЛГ и ионно-сшитый микрогель АЛГ/Са до концентрации 2 мг/мл. Катионный ПЛ вызывал гибель 50% клеток при концентрации LC50 = 2×10-5М. В тройном положительно заряженном комплексе АЛГ/Са/ПЛ и конъюгате АЛГ/Са/ПЛ/липосома ПЛ не проявлял токсичности до концентрации 6×10-5М. Докс в протонированной форме был загружен в анионный микрогель. Исходный микрогель ТС(-) не проявлял цитотоксичности до концентрации 2 мг/мл. Напротив, микрогель с максимальным содержанием Докс показал высокую токсичность, которая в пересчете на концентрацию Докс соответствовала LC50 = 6×10-6М. Эта величина была сопоставима с токсичностью свободного Докс. Катионные микрогели со звеньями НИПАМ, ТС(+), коллапсируют при повышении температуры окружающего раствора. Коллапс микрогелей обратим: охлаждение растворов приводит к восстановлению размеров микрогелей. Анионные липосомы электростатически адсорбировали на поверхности частиц микрогеля с 4% сшивателя при 25 °С, каждая частица микрогеля связывала до 30 анионных липосом, заполненных Докс. Целостность липосом после связывания с микрогелем сохранялась. Повышение температуры до 50 °С сопровождалось вытеканием Докс из липосом. При небольшом количестве адсорбированных липосом весь Докс переходил в окружающий раствор в течение 2 минут; при максимальном заполнении микрогеля липосомами в течение 10 и более минут. Предложены два механизма термо-индуцированного высвобождения лекарства из МК: за счет сжатия и последующего разрушения липосом при резком уменьшении площади поверхности микрогеля и в результате появления дефектов в липосомальных мембранах при их взаимодействии с цепями коллапсирующего микрогеля. Получен термочувствительный МК с инкапсулированным ферментом лакказой. Адсорбированные на микрогеле липосомы высвобождали фермент при повышении температуры; высвободившийся фермент взаимодействовал с субстратом, растворенным во внешнем растворе, давая цветной продукт. Получен микрогель путем ионного сшивания макромолекул КМЦ ионами Zn(2+), который дополнительно содержал аминосодержащий лиганд способный формировать комплекс с ионами цинка, обладающий противоопухолевой активностью. Комплекс цинка с лигандом нерастворим в воде, но приобретает растворимость после связывания с КМЦ, что заметно повышает биодоступность препарата. Проведенное исследование показало: как микрогель, так и липосомы в составе МК могут быть заполнены биологически активными веществами. Это заметно повышает емкость конъюгата и, как следует ожидать, эффективность терапевтического действия мультилипосомальных конструкций.
2 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Мультилипосомальные носители лекарственных веществ на основе полимерных микрогелей
Результаты этапа: Катионные липосомы получали ультразвуковой обработкой водной суспензии смеси липидов, состоявшей из электронейтрального яичного лецитина (ЯЛ) или диолеоилфосфатидилхолина (ДОФХ) и катионного диолеоилоксипропил-триметиламмоний хлорида (ДОТА+). Мольная доля катионного липида (v) в смеси лежала в интервале от 0.2 до 0.3. В работе также использовали флуоресцентно меченные липосомы и липосомы, внутренний объём которых был заполнен хлоридом натрия и лекарственными препаратами – доксорубицином (Докс) и цисплатином. Размер (гидродинамический диаметр) получаемых катионных липосом, измеренный методом динамического светорассеяния, находился в интервале 40-60 нм. Анионные микрогели формировали добавлением раствора СаCl2 к раствору полисахарида альгината натрия (АЛГ) с молекулярной массой 3.000.000. Мольное отношение карбоксильных групп АЛГ к ионам Са(2+) варьировалось от 20 до 4. Полученные смеси диализовали против дистиллированной воды и лиофильно сушили. Сухой продукт представлял собой альгинат натрия, сшитый внутримолекулярными ионными связями. После набухания в 0,01 M Трис-буферного раствора с рН 7 образцы «ионно-сшитого» АЛГ формировали микрогелевые частицы, размер которых (гидродинамический диаметр) составлял 190± 10 нм. В дополнение к этому в работе был использован синтетический микрогель (СМ), отрицательный заряд которого создавался карбоксильными группами акриловой кислоты. Размер частиц СМ, набухших в 0,01 M Трис-буферном растворе с рН 7, составлял 210 ± 10 нм. Добавление раствора липосом с v=0,3 к раствору ионно-сшитого АЛГ микрогеля сопровождалось нейтрализацией поверхностного заряда микрогеля и появлением положительно заряженных частиц в избытке липосом. Анализ профиля кривых электрофоретического титрования показал, что (1)катионные липосомы не вытесняли низкомолекулярные ионы Са(2+) из ионно-сшитого АЛГ и (2)все катионные липиды ДОТА+ в липосомах принимали участие в формировании электростатических комплексов с АЛГ. Нейтрализация поверхностного заряда микрогеля адсорбированными липосомами сопровождалась потерей коллоидной стабильности частиц комплекса и их агрегацией. В избытке липосом формировался «насыщенный» комплекс с максимальным количеством адсорбированных липосом, его размер составлял 300±20нм. Целостность катионных липосом в комплексе с анионными микрогелями АЛГ, заполненных растворами Докс или NaCl, оценивали с помощью методов флуоресценции и кондуктометрии соответственно. Формирование комплексов липосом с микрогелем не сопровождалось вытеканием Докс и соли из липосом, то есть не приводило к появлению дефектов в липосомальной мембране (нарушению ее целостности). Целостность липосом обеспечивалась тем, что они адсорбировались на «мягкой» поверхности гидрогелевых частиц. Такой механизм позволяет липосомам сохранять сферическую форму и блокировать возможность появления и последующего развития дефектов в липидном бислое. Помимо этого, катионные липосомы были адсорбированы на поверхности ковалентно сшитых анионных микрогелей. Целостность липосом в комплексе с микрогелем сохранялась по крайней мере в течение 1 часа. Для оценки цитотоксичности катионных липосом и их комплексов с микрогелем использовали MTT-тест. В качестве количественной меры цитотоксичности использовали значение концентрации добавленного вещества, при которой наблюдалась гибель 50% клеток (LC50). Более высокое значение LC50 означало меньшую цитотоксичность образца. Альгинатный микрогель не проявлял цитотоксического действия вплоть до концентрации 2 мг/мл. Для катионных липосом с v=0,2 значение LC50 составило 0,3 мг/мл, для насыщенного комплекса АЛГ-липосома 0,1 мг/мл в расчёте на липосомы. Таким образом, липосомы в комплексе с АЛГ показали более высокую цитотоксичность по сравнению со свободными катионными липосомами. Возможно, повышение цитотоксичности было связано с возрастанием размера и суммарного положительного заряда комплексной частицы по сравнению исходными липосомами. Для модификации поверхности частиц комплекса АЛГ-липосома были использованы два полимера линейного строения – природный полисахарид альгинат натрия, не обработанный солями двухвалентного металла (лАЛГ), и синтетический полимер, полиакриат натрия (лПАNa). Мультилипосомальный конъюгат АЛГ-липосома-лАЛГ получали, добавляя водный раствор линейного АЛГ к водному раствору насыщенного комплекса, приготовленного из микрогеля АЛГ и катионных липосом с v=0,2. Связывание анионного лАЛГ поверх слоя адсорбированных липосом сопровождалось формированием мультилипосомального конъюгата, состоящего из трех компонентов: ядра из анионного микрогеля АЛГ, промежуточного слоя из катионных липосом и поверхностного слоя из макромолекул линейного АЛГ. Такие МК несут высокий отрицательный поверхностный заряд, что позволяет им «мирно» сосуществовать с другими отрицательно заряженными компонентами биологической жидкости. Связывание лАЛГ с частицами комплекса АЛГ-липосома на начальном этапе сопровождалось агрегацией частиц с формированием агрегатов максимального размера в области нейтрализации заряда комплекса зарядом адсорбированного лАЛГ. Добавление бóльшего количества лАЛГ способствовало дезагрегации и появлению коллоидно стабильных частиц МК размером 390±20 нм. После связывания лАЛГ с частицами комплекса АЛГ-липосома полученный мультилипосомальный конъюгат был отделен центрифугированием, и супернатанты проанализированы на наличие лАЛГ в ходе титрования раствором катионного полимера (полилизина, ПЛ) известной концентрации. Результаты позволили описать состав МК (в терминах мольных концентраций его функциональных групп – анионных и катионных) следующей формулой: [АЛГ] = 2,5×10-4М, [ДОТА+] = 2,3×10-4 М и [лАЛГ] = 6×10-5М. Существенно, что целостность липосом сохранялась после формирования внешнего слоя из макромолекул анионного альгината. В цитотоксических экспериментах значение LC50 не было достигнуто вплоть до концентрации конъюгата равной 1 мг/мл. Полученный результат позволил сформулировать принципиальный вывод о способе построения мультилипосомальных контейнеров: в их составе могут быть катионные компоненты (например, липосомы), но они должны быть отделены от внешнего раствора покрытием из анионного полимера. Суммарный отрицательный заряд, привносимый полимерным покрытием, обеспечивает совместимость мультилипосомального конъюгата с другими отрицательно заряженными компонентами биологической среды. Для визуализации тройного МК АЛГ-липосома-лАЛГ был использован метод криогенной просвечивающей электронной микроскопии (крио-ПЭМ). Для придания дополнительного контраста альгинатным микрогелевым ядрам в них были внедрены наночастицы оксида железа (маггемита). На электронной микрофотографии были отчетливо видны частицы модифицированного микрогеля, окруженные плотным слоем нативных (неразрушенных) липосом. Другой способ визуализировать тройной МК связан с использованием метода STED микроскопии – разновидности флуоресцентной микроскопии, позволяющей получать изображения с высоким разрешением. Опушка из катионных липосом с флуоресцентной меткой хорошо видна на микрофотографии; размер МК на микрофотографиях коррелирует с размером, полученным с помощью других методов. В мультилипосомальном конъюгате жесткоцепной природный альгинат может быть заменен на гибкоцепной синтетический анионный полимер, полиакриловую кислоту (ПАК). Связывание ПАК на поверхности бинарного комплекса АЛГ-липосома формирует коллоидно устойчивые частицы отрицательно заряженного МК АЛГ-липосомы-ПАК со средним размером около. 300 нм. В мультилипосомальный конъюгат могут быть встроены липосомы с водонерастворимым лекарством – паклитакселом (ПТК), распределенным в гидрофобной части липидного бислоя. Заполненные ПТК катионные липосомы адсорбировали на поверхности АЛГ микрогеля и затем покрывали ПАК. Полученный тройной МК с ПТК инкубировали в холодильнике при температуре 4°С в течение месяца. При хранении МК в этих условиях его гидродинамические и электрокинетические характеристики сохранялись. Для МК, полученных по схеме «катионный микрогель + анионные липосомы», была сделана оценка их способности к внутриклеточной доставке лекарственных веществ. Роль катионного микрогеля выполняли частицы ионно-сшитого полисахарида хитозана. Цитотоксические тесты с участием нормальных клеток MCF7 показали следующие значения LC50 для (1)свободного Докс, (2)липосомальной формы Докс и (3)Докс в липосомах, включенных в МК: 1,3±0,2; 3,0±0,5 и 1,1±0,1 мкг/мл. Для клеточной линии OVCAR8, обладающей повышенной устойчивостью (резистентностью) к Докс, значения LC50 были равны (в той же последовательности лекарственных форм Докс) 145±33; 180±40 и 46±9 мкг/мл соответственно. Таким образом, включение Докс в мультилипосомальные конструкции позволяет создавать эффективные противоопухолевые препараты, эффективность которых может превышать таковую для традиционной липосомальной формы этого лекарства. Внутриклеточная доставка и распределение Докс анализировали методом конфокальной микроскопии, которая показала, что наиболее интенсивное окрашивание ядер клеток (основной цели Докс) наблюдается в том случае, когда лекарство вводится в клетки в составе мультилипосомального конъюгата. Эта методика будет использована для контроля внутриклеточной локализации Докс, доставляемого в клетки в составе тройных МК АЛГ-липосома-полианион. Управление скоростью высвобождения лекарства в зоне терапевтического действия является важной задачей нанофармакологии. Такая возможность была исследована на примере липосом со встроенным «молекулярным переключателем» – производным литохолиевой кислоты с двумя функциональными группами – карбоксильной и триазольной. Это соединение ориентируется в липосомальной мембране таким образом, что заряд молекулы (и всей липосомы) подстраивается под рН окружающего раствора: этот заряд отрицателен в щелочном растворе и положителен в кислом. Вращение переключателя в мембране при смене рН внешнего раствора сопровождается появлением дефектов в структуре липидного бислоя и вытеканием инкапсулированного водорастоворимого лекарства из липосом в окружающий раствор. В экспериментах с липосомами, заполненными Докс и противоопухолевым препаратом цисплатином, было показано, что рН-индуцируемое вращение переключателя сопровождалось высвобождением 50-60% инкапсулированного лекарства в течение первой минуты после изменения рН внешнего раствора. Примечательно, что для столь быстрого выхода лекарства липосомальная мембрана должны была содержать всего лишь несколько весовых процентов переключателя, что не сказывалось на цитотоксичности модифицированных липосом. Описанные липосомы будут использованы для получения рН-чувствительных мультилипосомальных конъюгатов.
3 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Мультилипосомальные носители лекарственных веществ на основе полимерных микрогелей
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".