![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Многие отклонения нейроонтогенеза характеризуются аберрантной пролиферацией и миграцией нейральных предшественников и, как следствие, измененными паттернами активации нейронов в развивающейся и сформированной нервной системе. Эти отклонения от нормального развития головного мозга могут варьировать от явных проявлений (например, как у микроцефалии, вызванной вирусом зика) до более тонких (как в некоторых проявлениях расстройств аутического спектра). Дефекты в делении клеток и миграции, наряду с измененной синаптической функцией и измененным метаболизмом, могут представлять существенный вклад в нейроанатомические, и, в конечном итоге, поведенческие проявления различных нарушений развития нервной системы. Одним из ограничений в выявлении изменений в делении нервных предшественников и их миграции в случаях нарушенного развития нервной системы является очень сложная пространственная и временная структура этих процессов в развивающемся (эмбриональном и перинатальном) мозге. Традиционный анализ, обычно ограниченный двумерными сегментами мозга человека или животных, как правило, не охватывает весь масштаб изменений, происходящих в пространстве и времени, и не позволяет обнаружить тонкие отклонения от основного плана развития мозга; а именно такие отклонения сопровождают ряд заболеваний, затрагивающих нейроонтогенез. Кроме того, обычный анализ с использованием маркеров клеточного цикла не позволяет различить возможные сценарии каскадов деления, дифференцировки, и выживания клеток в развивающемся мозге. Даже когда изменения в пролиферации и миграции клеток при нейроонтогенетических отклонениях могут быть выявлены, следующая задача состоит в том, чтобы понять клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе этих дефектов. Часть заболеваний, связанных с нарушениями развития мозга, тесно связаны с идентифицированными генами и сигнальными каскадами, которые регулируются этими генами. Однако в большинстве случаев нарушений развития мозга, включая расстройства аутического спектра (в дальнейшем – аутизм), генетический анализ указывает на большое количество генов и сигнальных путей, участвующих в расстройстве, затрудняя или делая невозможным прямой генетический анализ. Животные модели, в особенности мышиные модели, воспроизводят некоторые важные особенности дефектов развития мозга и, в частности, аутизма. Дефекты в делении клеток и миграции, наряду с изменениями поведения, очевидны в нескольких мышиных моделях аутизма, указывая на адекватность и пользу этих моделей для изучения изменений развития нервной системы. Важной задачей является визуализация и количественная оценка изменений в динамике деления клеток и миграции во целом мозге животного (т.е., пространственно-временной паттерн). Еще одна проблема заключается в масштабировании подобных методов, с тем чтобы можно было анализировать десятки мозгов животных моделей параллельно. До сих пор эти проблемы не были решены, и именно на них направлен предлагаемый план исследований. Целью предлагаемого исследования является использование животных моделей аутизма для определения изменений в делении и миграции клеток и в общем паттерне активации нейронов при аутизме. Наш план исследований направлен на использование мышиных генетических моделей аутизма: линии 16p11.2 (df/+), содержащей делецию участка хромосомы, гомологичного человеческому участку 16p11.2, связанного с частью случаев аутизма, а также комплементарной ей линии 16p11.2 (dp/+) с дупликацией этого участка. Наш план базируется на разработанных нами новых методах выявления дефектов в пространственном и временном паттернах деления клеток и их миграции в перинатальном мозге, а также изменений в активации нейронов в этих моделях. Таким образом, конечная цель проекта - получить информацию о клеточных и молекулярных механизмах, ведущих к нормальному развитию мозга и изменениям, вызванным аутизмом. Важно отметить, что предлагаемое к расмотрению исследование фокусируется на механизмах, которые могут быть общими для большинства расстройств нервно-психического развития, в том числе с неопределенными или неясными этиологиями и генетическими основами.
Numerous neurodevelopmental disorders are characterized by aberrant proliferation and migration of neural precursors and altered signaling within and in close proximity of these precursors and their progeny. These deviations from the normal course of brain development may range from severe (as in zika infection-induced microcephaly) to much more subtle (as in some manifestations of the autism spectrum disorders, hereafter in the proposal called autism for brevity). Defects in cell division and migration may be essential contributors to the neurobiological (and ultimately behavioral) manifestations of various neurodevelopmental disorders, along with changes in synaptic function and altered metabolism. One of the limitations in identifying the changes in division of neural progenitors and their migration in neurodevelopmental disorders is the highly complex spatial and temporal pattern of these processes in the developing (embryonic and perinatal) brain. Conventional analysis, usually limited to two-dimensional sections of the human or animal model brain does not grasp the entire scale of perturbations occurring in space and time; likewise, it is difficult to detect subtle deviations from the basic plan that accompany neurodevelopmental disorders. In addition, the usual analysis, employing cell cycle markers, does not discriminate between various scenarios of the division/differentiation/survival cascades that take place in the developing brain. Even if the defects in cell proliferation and migration in the affected brain are identified, the next challenge is to understand the cellular and molecular mechanisms that underlie those defects. For a number of neurodevelopmental disorders the defects are closely linked to identified genes and the pathways that they regulate. However, for most neurodevelopmental disorders, including autism, genetic analysis points to a large number of genes and signaling pathways involved in the disorder, complicating direct genetic analysis. Mouse models reproduce some of the features of autism. Defects in cell division and migration are obvious in several mouse autism models, justifying their use for studying proliferation-related changes in brain development. An important challenge is to visualize and quantify alterations in the dynamics of cell division and migration in the entire brain of the animal (i.e. the spatio-temporal pattern). Yet another challenge is to visualize the spatio-temporal pattern of signaling during normal and aberrant brain development. An additional challenge is to scale up the methods for processing dozens of brains in parallel. So far these challenges have not been met. Our proposal specifically targets these challenges. The goal of the proposed study is to use animal models of autism to determine changes in cell division and cell migration and in the general pattern of neuron activation in autism. Our research plan focuses on the use of mouse genetic autism models: the 16p11.2 (df / +) line, containing a deletion of a chromosome region homologous to the 16p11.2 human segment, associated with cases of autism, as well as a complementary 16p11.2 line (dp/+) with duplication of this site. The plan is based on a suite of new methods developed by us for detecting defects in the spatial and temporal patterns of cell division and their migration in the perinatal brain, as well as changes in neuronal activation, as applied to these models. Thus, proposal's overarching goal is to gain insights into the cellular and molecular mechanisms driving normal brain development and understand the autism-induced changes. Importantly, it focuses on the mechanisms that may be common to most neurodevelopmental disorders, including those with uncertain or obscure etiology and genetic underpinnings.
(1) Аутизм связан с пока неясными дефектами нейроразвития, связанными с множественными генами и с различными процессами, такими как пролиферация, миграция, и активация. Мы определим пространственно-временные закономерности деления и миграции нейральных предшественников на мышиных моделях аутизма. (2) Аутизм проявляется в отклонениях активации нейронных цепей и, в конечном итоге, в поведении. Мы определим изменения в глобальных паттернах активации нейронов, визуализируемых за счет экспрессии гена c-fos, который маркирует возбужденные нейроны. (3) Мы применим набор новых методов, разработанных в нашей группе, и сделаем их доступными исследователям, изучающим различные нейропсихиатрические расстройства. (4) Разработанный нами 4D-анализ постнатального развития в моделях аутизма может быть применен, в том числе, и другими научными группами, для исследования других нарушений нервно-психического развития, в том числе таких, чья генетика и этиология пока неясны.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 24 апреля 2019 г.-15 декабря 2019 г. | Этап 1 |
Результаты этапа: За 1 год выполнения проекта были проведены все необходимые подготовительные мероприятия с мышами двух линий аутистических мышей 16p11.2 (df/+) и 16p11.2 (dp/+): мыши были получены, было налажено их размножение и начата наработка животных двух линий в количестве, необходимом для проведения исследований. Было проведено исследование по выявлению токсических эффектов EdU, была определена оптимальная доза EdU для экспериментов. В ходе этих экспериментов были обнаружены негативные эффекты введения EdU на ранний постнатальный онтогенез мышат, выражающиеся в снижении скорости набора массы тела. Выявленный эффект был доза-независимым. На основании полученных данных, для дальнейших исследований нами была выбрана доза 40 мг/кг, как оказывающая минимальный эффект на новорожденных. Полученные данные будут использованы в планировании будущих экспериментов: поскольку разница с контролем для выбранной дозы начинает проявляться только после Р10, динамическая 3D визуализация возрастной динамики деления и миграции клеток в развивающемся мозге аутистичных мышей в будущих экспериментах будет производиться только для первых десяти дней жизни мышат. Была произведена доработка разработанных нами ранее алгоритмов для вписывания мозга мутантных животных в референтную модель мозга дикого типа и их качественного сравнения, а также алгоритмов вписывания мозга новорожденных животных в референтный трехмерный атлас развивающегося головного мозга. Полученные алгоритмы позволяют выполнять качественное сравнение образцов мозга мутантного типа и дикого, что является не тривиальной задачей ввиду возможных морфологических различий или существенных различий в паттернах деления клеток. При этом, представленная схема съемки в двух каналах и последующих трансформаций на основе дополнительного канала позволила достоверно и очень точно совместить изображения множества образцов в 3D. Разработанный интерфейс позволил создать полуавтоматическую систему обработки серии образцов, существенно ускорив процесс анализа и получения результатов. С помощью разработанных алгоритмов было осуществлено сравнение паттернов деления клеток в мозге развивающихся (Р5) и взрослых мышей (Р56) с делецией участка хромосомы, гомологичного человеческому 16p11.2. Были обнаружены признаки микроцефалии у мышей 16p11.2df, а также различия между паттернами пространственного распределения делящихся клеток во взрослом мозге у мышей мутантов 16p11.2df и животных дикого типа. Различия касались обонятельной луковицы и СВЗ, а также, вероятно, субкаллозальной зоны. Возможно, у аутистичных мышей линии 16p11.2df может наблюдаться некоторый дефицит в глиогенезе, однако, однозначно это утверждать можно только после проведения более подробного исследования и количественного анализа. Также разница в плотностях клеток в СВЗ и обонятельной луковице может говорить о меньшей скорости миграции клеток у мутантных мышей. Для оценки клеточных делений в гиппокампе качественному 3D анализу не хватает чувствительности и требуется применение количественной оценки. На 5 сутки после рождения у мышей-мутантов 16p11.2df не было выявлено признаков микроцефалии, а также значимых различий в пролиферации клеток в сравнении с контролей. По всей видимости, изменения в клеточной пролиферации надо искать в более поздних возрастах, либо при отсутствии их на поздних этапах – анализировать выживаемость клеток. | ||
2 | 1 января 2020 г.-15 декабря 2020 г. | Этап 2 |
Результаты этапа: 1. Было проведено исследование когнитивных эффектов делеции и дупликации участка хромосомы 16p11.2 у взрослых мышей. В тесте на тревожность в приподнятом крестообразном лабиринте были выявлены межполовые различия у аутичных животных: если самцы Df/+ в тесте вели себя так же, как животные дикого типа, то самки Df/+ продемонстрировали повышенную тревожность (выраженную меньшей дистанции, пройденной в открытых рукавах ПКЛ) по сравнению с диким типом. Также было проведено исследование социального поведения мышей обеих линий. Самки линии Df/+ продемонстрировали предпочтение социального партнёра, однако проводили равное время со знакомым и новым партнёром. Самки дикого типа продемонстрировали одинаковый интерес к новому объекту и партнеру; при тестировании распознавания, также, как мыши Df/+, они проводили равное время с новым и знакомым социальным партнером. Самцы Df/+ продемонстрировали одинаковый интерес к новому объекту и партнеру; при тестировании распознавания аутичные животные проводили равное время с новым и знакомым социальным партнером. Самцы WT продемонстрировали предпочтение социального партнёра. При выборе между знакомым и новым партнером они проводили достоверно больше времени с первым, что может свидетельствовать о социальной неофобии. Результаты тестирования социализации и социального предпочтения свидетельствуют о необычном для данного теста поведении животных линии WT, что затрудняет интерпретацию результатов, полученных для Df/+. Эксперименты по исследованию социализации у самок и самцов линии DP/+ не позволил получить однозначный ответ на вопрос о наличии или отсутствии дефицита социальных взаимодействий у этих мышей. Как и при работе с мышами линии Df/+ было обнаружено нетипичное поведение мышей дикого типа в тесте социализации в трехсекционной камере. Животные WT либо не демонстрировали предпочтения социального партнера, проводя равное время с ним и с объектом в противоположном отсеке камеры (самцы), либо, избегали социального партнера (самки). 2. Было произведено исследование динамики возрастных изменений 3D паттернов деления клеток в развивающемся мозге мышей линий 16p11.2 (df/+). Качественный 3D анализ паттернов деления клеток в мозге новорожденных мышей с делецией участка хромосомы, гомологичного человеческому 16p11.2, был проведен с 0 по 10 сутки постнатального развития. У мутантных животных начиная с 4 суток наблюдалась низкая масса тела по сравнению с контролем, за счет чего отношение массы мозга к массе тела было достоверно выше у мутантных животных по сравнению с мышатами дикого типа. Попарное наложение (Df/+ -> WT) групповых изображений мозга новорожденных разных возрастов друг на друга не выявило явных отличий Df/+ мышей от мышат дикого типа: расположение нейрогенных зон, их плотность, размеры полностью совпадали с контрольными животными. Сравнение пролиферации у животных двух генотипов также не выявил разницы в возрастной динамике пролиферативной активности. Таким образом, у новорожденных мышей Df/+ не было выявлено признаков микроцефалии, а также значимых различий в пролиферации клеток в сравнении с контролем. Несмотря на сниженную массу тела траектория развития мозга мутантных животных в первые 10 дней постнатального онтогенеза не отличается от контрольных животных. 3. Было проведено 2 серии экспериментов на взрослых самцах и самках линий Df/+ и Dp/+ в возрасте 2-2.5 месяцев. В первой серии мутантных самцов скрещивали с самками дикого типа B6129SF1/J. Животным вводили синтетический аналог тимидина EdU в дозе 40 мг/кг три раза с интервалом 4 ч, перфузию осуществляли через 24 ч после последней инъекции. Данная схема позволяет выявлять миграционные пути в нейрогенных зонах в трехмерном виде. Во второй серии мутантных самцов скрещивали с гомозиготными самками Nestin-H2B-GFP, у которых зеленый флуоресцентный белок экспрессируется с ядерной локализацией в стволовых клетках. Гибридным мышам дикого типа и мутантам делали три инъекции BrdU в дозе 50 мг/кг с интервалом 12 ч. Через 21 день мышам вводили EdU в дозе 40 мг/кг и через 2 ч перфузировали. Такая схема позволяет выявлять число новых нейронов, а также производить оценку состояния нейрогенной ниши. В общей сложности после генотипирования в первой серии было набрано не менее 7 мышей на группу, во второй серии – не менее 5 мышей. Анализ этих образцов будет осуществлен на 3 году проекта. | ||
3 | 1 января 2021 г.-31 января 2021 г. | "Изменения в пространственно-временных паттернах развития мозга и активации нейронов при аутизме" |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".